灵芝液体深层发酵技术研究进展

屈直++谢晴宜++马海霞

摘 要 灵芝是我国著名的药食兼用大型真菌。对近年来灵芝液体深层发酵技术在菌种选育、培养基优化以及发酵参数选择等方面的研究进展进行总结阐述。

关键词 灵芝 ；液体深层发酵技术 ；研究进展

分类号 Q939.97

Recent Advances in Liquid Submerged Fermentation Technology of

Ganoderma lucidum

QU Zhi XIE Qingyi MA Haixia

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Hainan 571101， China）

Abstract Ganoderma lucidum is famous for the medicinal fungi and new food resources. The recent advances in research on the stain improvement， medium optimization and the fermentation parameters selection were briefly introduced， as well as the prospect for the development of liquid submerged fermentation technology of Ganoderma lucidum.

Keywords Ganoderma lucidum ； liquid submerged fermentation ； research progress

灵芝（Ganoderma lucidum），俗称赤芝、红芝、木灵芝，古称瑞草，是我国著名的药食兼用大型真菌，其孢子、菌丝和子实体均可利用，药用历史悠久，古典医书对灵芝的药用功效均有记载，认为灵芝是祛病延年、滋补强壮、扶正固本、有利于机体保持或恢复稳态的珍贵药品，可用于多种疾病的治疗[1]。现代药理研究表明，灵芝中已经分离到150 余种化合物，其中主要的生理活性物质为灵芝多糖和灵芝三萜，它们具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、消炎抗菌、保肝护肝、调节免疫、促进新陈代谢等功效，且几乎无毒副作用，受到医药界的广泛重视。传统上，灵芝是通过野外采集或人工栽培获得。目前，灵芝野生资源稀缺，而人工栽培投入成本高，生长周期长（2～3个月以上），劳动强度大，易受季节、环境、区域、原料等因素制约，品质难以控制[2-3]；此外，传统上灵芝以子实体或孢子入药，子实体味苦，木质化、纤维化程度高，孢子细胞壁厚，机体较难吸收利用，不宜直接用作食、药原料[4]。1973年，林忠平等[5]以灵芝、紫芝为试验材料，进行了一系列液体深层发酵技术的相关研究，此后，国内外学者相继展开了对液体深层发酵技术的应用研究与探讨，其培养技术日趋成熟和完善。与传统方法相比，该技术具有周期短、成本低、产出多、利于工业化、培养物营养丰富且质量稳定，以及提取分离容易等优点，而且灵芝深层培养液苦味小，营养和药用价值不低于子实体甚至有些指标高于子实体。液体深层发酵生产灵芝已显示出明显的优势，具有广阔的应用前景。

1 菌种选育研究

优良菌种的选育是提高灵芝液体深层发酵水平的基础和关键。目前，常用的育种手段有自然选育、诱变育种和杂交育种。从野生灵芝经组织分离、纯化所获得的菌株，对自身固有的代谢调节系统较为依赖，趋于稳定生长和繁殖，长速慢，生产能力低，无法为液体深层发酵提供其所需的大量灵芝菌种[6]。从现有研究来看，采取孢子、原生质体等诱变育种仍是灵芝菌种选育主要途径。朱芬等[7]在对供试灵芝菌株进行原生质体紫外诱变的基础上，经过多重筛选试验，获得了菌丝干重和三萜含量稳定提高的诱变株UV-3。董玉玮等[8]采用氯化锂诱变赤灵芝原生质体，所得诱变株液体发酵目标产物产量有较大提高。董玉玮等[9]采用紫外线与甲基磺酸乙酯、紫外线与氯化锂复合诱变灵芝原生质体，所得诱变株胞外多糖产量较原发菌株分别提高49.75%和57.87%，遗传稳定性较好。王淑珍等[10]对灵芝孢子进行紫外线与60CO-γ射线交替积累诱变处理，所得诱变株菌丝生长速度快，菌丝积累量、遗传稳定性均较好。李颖颖等[11]、谢瑀婷等[12]通过低能N+离子注入方法诱变灵芝孢子，取得了较好的试验结果。随着遗传学、生物化学、微生物学等学科的快速发展，转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等已应用到灵芝育种中。高明侠等[13]采用原生质体电融合技术选育高产多糖菌株，所得融合株的生物量和多糖含量均高于亲本菌株。李刚等[14]建立了通过PEG转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，为通过基因工程手段定向、快速改良灵芝药用品质以及利用灵芝发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等应用奠定基础。

此外，灵芝深层发酵优质高产菌株的筛选研究已开展较多，通过综合比较分析菌丝生长速度、菌丝体生物量及目标产物含量等指标选育出适应性强、遗传性状稳定、目的产物得率高的优势菌株。王磊等[15]比较了8 个灵芝菌株的菌丝生长速度、菌丝体生物量及多糖含量等指标，筛选出优势菌株。宋频然等[16]运用反馈抑制理论构建了耐灵芝胞外多糖（EPS）反馈抑制的筛选模型，并用其筛选37株灵芝菌株，最终检出耐灵芝胞外多糖反馈抑制作用最强、产胞外多糖能力最强的菌株GL029。余素萍等[17]通过摇瓶培养试验，从22个灵芝菌株中筛选出三萜高产菌株GL31。王雁萍等[18]应用添加亚硒酸钠（Na2SeO3）的培养基筛选富硒能力较强、菌体生物量及菌体多糖产量均较高的菌株。

2 培养基优化

目前，已有较多学者对灵芝液体发酵培养基成份进行了优化研究，但是由于各研究的供试菌株及原材料有所不同，因此培养基优化的结果也不尽相同，无法进行相互比较。endprint

2.1 碳源

灵芝液体发酵所需的碳源来源广泛，常见的有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉等。董元荣[19]开展了灵芝液体发酵所需碳源的筛选试验，指出玉米粉为最佳碳源。余以刚等[20]研究了碳源对灵芝液态发酵的影响。结果表明，红芝对单糖、双糖和多糖均能较好地利用，其中以葡萄糖为碳源时得到的生物量和胞外粗多糖产量最多。刘冬等[21]对15 种常用碳源进行筛选研究，发现最适碳源单糖为葡萄糖，二糖为蔗糖，多糖为玉米粉、小麦面粉、麸皮粉或土豆粉，灵芝菌丝体的长速以在葡萄糖为碳源的液体培养基中最快，蔗糖次之，多糖最慢。此外，一般认为复合有机碳源更有利于灵芝菌及其次生代谢产物的生成。李平作等[22]研究显示，除葡萄糖外，在培养基中添加组分较复杂且富含半纤维素、纤维素的复合碳源如玉米粉、酒糟等可获得较好的发酵效果。复合碳源具有原料来源广泛易得、成本低廉的优势，适应产业化、规模化生产的需求。

2.2 氮源

氮源主要是合成灵芝真菌细胞合成核酸、蛋白质及次生代谢产物不可或缺的物质基础。刘冬等[21]报道，用酵母膏、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨等有机氮源进行灵芝液体发酵时，菌丝体的产量明显高于无机氮源，可见灵芝菌丝体对有机氮源的利用能力要优于无机氮源。Hsieh CY[23]研究表明，蛋白胨和酵母提取物对于灵芝菌丝的生长刺激作用显著，但加入量过高会抑制细胞的生长和产量。常景玲[24]报道，将麸皮（5%）和蛋白胨（0.3%）搭配作为氮源，比单一的麸皮或蛋白胨作为氮源对菌丝体与多糖的产生更有利。

2.3 碳源、氮源浓度及碳氮比（C/N）

培养基的优化，除考量碳、氮源的组成外，碳、氮源浓度及合适的碳氮比也是需要着重考虑的。只有二者均在合适的浓度下，菌丝体才能兼顾生长和次生代谢产物的形成。李平作等[25]报道，较高的C/N有利于灵芝多糖的生成；在C/N确定时，太高的碳源浓度对菌丝体生长存在抑制作用，影响发酵周期；氮源浓度对发酵的周期影响不大，但对灵芝多糖及灵芝酸的产量是有影响的。刘冬等[21]研究认为，最佳碳氮比为23.6～31.1。Babitskaya[26]研究表明，当碳氮比值于18.0～25.0时，对多糖的生成最为有利。Hsieh CY[23]试验证实，充分的碳源供给是保证菌丝体中多糖产量的关键。罗建成等[27]报道，灵芝菌丝体生物量和胞外多糖含量在一定的范围内随着葡萄糖含量增加而升高，但当葡萄糖含量大于5%时，灵芝菌丝体的生长将受到抑制。黄达明等[28]对碳源、氮源的筛选结果显示，含有酮基的碳源、氮源要优于不含酮基的，且只有在一定的碳氮源浓度范围内才能较好地合成灵芝酸。

2.4 无机盐

灵芝在液体深层发酵过程中需要添加少量的无机盐，如磷、钾、镁、硫和钙等，菌丝生长的最基本元素为磷、钾和镁，磷参与糖代谢，镁离子参与菌体生长，钾对糖酵解有促进作用。刘冬等[21]报道，培养基中Mg2+、P5+缺乏对菌丝体生物量影响较大，而K+缺乏时菌丝体几乎不生长。Hsieh CY[23]研究发现，磷酸盐缺乏可导致胞内多糖产量显著降低，而限量添加Mg2+则会获得较低含量的大分子多糖。其它一些无机盐，如钙离子，一般使用碳酸钙调节发酵液酸碱度；硒和锌等元素，灵芝可将这些无机态的矿质元素生物富集，进而转化成有机态的矿质元素，更易于人体吸收。魏赛金等[29]探讨了在培养基中添加不同浓度的锌离子对灵芝菌丝生长和液体发酵富集Zn2+的影响。胡志斌等[30]就不同水平亚硒酸钠对灵芝液体发酵的影响进行了研究，数据显示液体发酵培养基中硒浓度为250 μg/mL时获得的菌丝体生物量最高。

2.5 生长因子

灵芝液体培养需要一定量维生素类物质，特别是维生素VB1（硫胺素），它在灵芝生长过程中不能自己合成，必需从外界补充，对灵芝菌丝体生长和生物活性物质生成有着重要作用。刘冬等[21]通过试验发现，缺乏VB1、VB2对菌丝体生长有部分影响。胡焕荣[31]认为，在培养基中加入150 mg/L VB1，能促使灵芝菌丝体生长粗壮。陈芳莉等[32]探讨了维生素与灵芝菌丝体生长及其胞外多糖生成间的关系，结果表明，VB2与VB6对菌丝体生长均有促进作用，且可使其生成较多的胞外多糖，VB2较VB6作用更为明显。另据陈志玲等[33]报道，液体培养时加入适量的复合VB、VB1、铁和锌可使灵芝多糖及灵芝酸产量显著地提高。

2.6 非必需营养因子

据有关报道，不同脂肪酸类物质、醇类及中药提取物对灵芝液体深层发酵也有着不同的影响。Yang FC等[34]研究显示，脂肪酸对灵芝菌丝体生长及次生代谢产物形成等有一定的影响。Yang HL等[35]研究认为，在液体发酵培养基中添加甲醇、乙醇和1-丙醇能使多糖产量分别提高1.0、2.4和1.8 倍。刘媛等[36]报道，在培养基中添加金银花、淡豆豉、淡竹叶、连翘和甘草等对灵芝菌丝体生长及灵芝酸生成均有一定的促进作用；薄荷和芦根能促进灵芝菌丝体生长，但不能促进灵芝酸生成。

3 发酵条件控制

灵芝液体深层发酵的目的是要得到高生物量及高产量的次生代谢产物；但在实际发酵过程中，二者难以同时达到高产，故此，要根据实际生产需要选择有利于目标产物生成的发酵条件。

3.1 培养温度

灵芝属高温型真菌，其深层发酵的温度范围较广，在22～35℃内都可以生长。Babitskaya[26]报道，最适于供试菌株菌丝体生长和灵芝多糖积累的温度范围在25～30℃，低于25℃或高于30℃菌丝体生物量和灵芝多糖含量则显著减少。Chang MY等[37]在研究中发现，灵芝液体发酵的最适温度为34℃。综上所述，最适温度因不同情况而有所不同，存在一定的差异性，这可能与菌种本身及其它发酵因素（如培养基成分、pH值等）共同引起的。

3.2 pH值endprint

液体发酵过程中，培养基的pH值对菌丝体生长也存在较大的影响，过酸或过碱对灵芝菌丝体的生长都是不利的；pH值也是影响次生代谢产物产生的重要因素，其变化会导致各种酶活性的改变，从而影响次生代谢产物的形成。李平作等[37]研究显示，适合于多糖形成的pH值与适合于菌丝生长的pH值并不一致。Fang QH等[39]针对液体发酵初始pH值对菌丝体生物量及其生物活性物质含量的影响进行了研究，结果表明初始pH值为6.5时，生物量和灵芝酸含量达到最高；而当初始pH值下降时，灵芝多糖含量随之上升。Kim等[40]认为，灵芝发酵过程中分段控制pH值也是提高胞内多糖与胞外多糖的有效方法。凌庆枝等[41]试验证明，pH值与菌丝生长、胞内外灵芝酸及胞外多糖生成紧密相关，菌丝生长及胞内灵芝酸形成最适pH值是5.5，胞外多糖形成最适pH值是4.6，胞外灵芝酸形成最适pH值是4.5。

3.3 培养时间

灵芝的液体深层发酵首先是摇瓶培养得到种子液，然后在发酵罐中发酵培养获得大量的次生代谢产物。杨炎等[42]试验发现，赤芝G2在液体深层发酵前32 h处于生长延滞期，生物量增加很小，而在发酵76 h生物量达到最高。余素萍等[43]研究显示，菌丝中三萜类物质主要在培养后期大量生成，但并非培养时间越长，其含量就越高。培养至一定时间后，三萜类物质减少或只在组分间相对比例上有所变化。Yang FC等[44]报道，供试菌株在2 L发酵罐中进行液体发酵时，灵芝多糖含量从第2 d开始呈S型曲线上升，至第5 d达到最高浓度，且开始趋于稳定；此外，发酵罐中灵芝多糖的产出与通气量还有着较大的关系。因此，实际生产中应根据目标产物来选择适宜的培养时间。

3.4 种龄和接种量

生长旺盛、活力强的种子是菌丝体的生长和次生代谢产物产生的基础。一般认为，处于对数生长中期的种子更有利于菌丝体的生长，摇瓶种子液的培养周期确定为3 d左右较好。

接种量的多少关系到菌丝体的生长、形态进而影响其次生代谢产物的生成。Fang QH等[45]认为，接种量干重在330 mg/L时，菌丝体干重可达到最高；当接种量干重在70～670 mg/L时，接种量减少，菌球直径变大，灵芝酸含量增多；接种量增加，菌球直径变小，多糖含量增多。由此可以看出，较低的接种量有利于灵芝酸的产生；而高的接种量有利于灵芝多糖的产生。杨炎等[42]试验发现，接种量的确定应综合培养周期和培养基的利用率，定为10%较为适宜。在实际生产过程中，应随其它发酵条件的设置而所有差别，可根据所需的有效组分控制接种量。

3.5 振荡频率、转速及溶氧

灵芝是好氧真菌，氧气供给不足会抑制其生长代谢。种子液摇瓶培养时的振荡频率和发酵罐发酵时的转速与通气量，都和溶氧紧密相关。李平作等[46]在试验中发现，在25 L发酵罐内选择180 r/min的转速和1∶0.75 v/v·m的通气量效果较好，较高的转速可致菌丝球较小，但有利于胞内多糖的形成[22]。Tang YJ等[47]报道低溶解氧（10%左右）时，菌丝体生长受阻，但胞外多糖和胞内多糖的产量却高于溶解氧25%时的产量；除此还发现，初始体积溶氧系数（KLa）较高时可得到高生物量和高胞内多糖产量，当KLa再增加时，菌丝球直径增大，发酵10 d后得到的灵芝酸产量较高。另据报道，在灵芝液体发酵过程中，其菌丝体生长与胞外多糖生成所需要的最适溶氧是基本一致的，均在 80%左右，超过这一水平，对胞外多糖的生成不利[48]。

4 展望

采用液体深层发酵技术培养灵芝，在一定程度上克服了采收野生灵芝和栽培灵芝的局限性。此外，该技术可在短时间内制备出的大量的优质液体菌种，缩短制备原种和栽培种时间，便于工厂大规模生产；通过发酵又可分泌得到大量的胞外活性物质，将其用于研究开发保健食品、保健药品和治疗药物等。这些都极大地推动了液体深层发酵技术在灵芝中的应用。目前，学者们在优良菌株的选育、培养基的筛选、培养条件的优化、发酵工艺的改良等方面都进行了有益的探索，提高了灵芝液体深层发酵的技术水平，但在研究和生产中仍存在着一定的问题，如发酵培养基和工艺条件适用性不广、菌种质量要求高、不同规模发酵结果差异较大、发酵过程易染菌、难以确定发酵终点、适于发酵工业的品种比较少、次生代谢产物产量还无法同子实体相比等。今后应从以下几个方面加强研究：加强最适发酵培养基、培养条件的筛选和优化；采用理化诱变、原生质体融合和基因工程等方法选育优良菌种；找出发酵规模不同而致发酵结果差异的主要原因，设法缩小其差异；提高对发酵过程动态监控水平；改善液体工艺条件和发酵设备；根据不同的发酵目的和发酵工艺，综合考虑经济、产品质量等因素，确定发酵终点等。随着灵芝液体深层发酵研究的系统和深入及各种生物反应器的研制成功，必将提高灵芝的发酵水平和资源利用效率，促进灵芝在医药食品等领域发挥更大的作用。

参考文献

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