红锥组织培养与快速繁殖的研究

覃子海等

摘 要 以红锥茎段为外植体， 研究了不同激素对其再生体系建立的影响。结果表明：最适诱导培养基为 BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.25 mg/L，诱导率达到了85%；最适增殖培养基为BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L，芽增殖系数3.58，且生长健壮；单芽在1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L培养基上生根效果好，生根率82%；炼苗成功后移栽成活率达90%以上。

关键词 红锥 ；组织培养 ；快速繁殖

分类号 Q813.1+2

Tissue Culture and Rapid Multiplication of Castanopsis hystrix

QIN Zihai1） LIU Hailong1） JIANG Hua2） QIN Pengfei3） ZHU Jiyu1）

（1 Guangxi Forestry Research Institute， Nanning，Guangxi 530001；

2 Weidu State Forest Farm of Guangxi， Laibin， Guangxi 546100；

3 Daguishan State Forest Farm of Guangxi， Hezhou， Guangxi 542800）

Abstract The effects of different hormones on regeneration system of Castanopsis hystrix were analyzed by using the stem as explants. The results showed that the suitable media for induction were BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.25 mg/L， with the induction of 85%， the suitable media for proliferation were BMT+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.5mg/L，with the multiplication coefficient of 3.58， moreover robust growth， the suitable media for rooting were 1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L， with the rooting of 82%. The seedlings had survival rate of over 90% after hardening and transplanting .

Keywords Castanopsis hystrix ； tissue culture ； rapid multiplication

红锥（Castanopsis hystrix）属壳斗科栲属常绿乔木，是华南地区重要的乡土阔叶优质珍贵用材和多用途树种[1-2]。它具有生长快、萌芽力强、混生性能好等优良特性，是与松、杉等针叶树种混交造林的最理想的伴生树种之一[3]。目前红锥人工造林是以种子育苗造林为主，但因红锥母树林结实的大小年现象十分明显，结实小年常因采不到种子而无法满足造林之需求[4]。因此，建立红锥组培再生繁殖体系，对红锥的开发和利用具有重要的意义。关于红锥组织培养形成再生植株的研究尚未见报道，本研究以红锥茎段为外植体， 探讨了不同激素组合对其再生体系建立的影响，旨在为红锥的快速繁殖和规模化育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

组织培养材料来自于红锥优株的萌芽条。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒

剪取红锥萌芽条带腋芽茎段作为外植体，去叶，剪切成1～2 cm长带1～2个腋芽或茎节小段。用75%乙醇浸泡20 s，蒸馏水清洗后置于超净台上，在无菌操作下用0.1%升汞消毒8 min，再用20%次氯酸钠消毒5 min，消毒处理后用无菌水漂洗5～6次。

1.2.2 始芽的诱导

细胞分裂素对始芽的诱导起着十分重要的作用，要使嫩芽获得较高的诱导率，适宜的细胞分裂素浓度甚为关键。离体培养常用的生长素为NAA，细胞分裂素为6-BA，以生长素NAA 0.25 mg/L为基础，在含0.1～0.5 mg/L不同浓度的细胞分裂素6-BA的BMT培养基上[5]，另加CH 500 mg/L，VB2 1 mg/L，pH为5.8。每试验处理接种20段，光照培养，定期进行诱导率的统计。

1.2.3 芽增殖和生长

将初代培养所得的芽接种在增殖培养基上进行继代培养，调节6-BA、KT、NAA的浓度，共设计9个试验处理，每处理接种芽20颗，不定期观察芽的分化、增殖和生长状况，并统计芽的增殖系数。

1.2.4 生根培养

当红锥芽继代培养扩大繁殖到一定数量并生长到3～4 cm高时，选取生长健壮的单芽切割进行生根培养试验。试验采用L9（34）正交试验设计，试验设计考虑的因素为生长素IBA和NAA以及基本培养基BMT，因素水平安排见表1。培养第5天开始观察，培养30d时统计各试验处理的生根率。

生根率（%）=生根株数/接入的无根苗数×100%

2 结果与分析

2.1 始芽的诱导试验

细胞分裂素6-BA对始芽诱导分化的影响效果见表2。

表2显示，当6-BA的浓度为0.1 mg/L时，始芽的诱导率很低，仅为25%，又多为生长纤细的单芽，而且部分顶芽变黄。在一定范围内，随着细胞分裂素6-BA浓度增加，外植体始芽的诱导率也呈相应提高趋势，当细胞分裂素6-BA为较高浓度0.4 mg/L时，初始芽的诱导率出现下降的趋势，而当浓度提高到0.5 mg/L时，始芽呈短粗密集，接种操作时极难切割剥离，且芽呈透明水肿玻璃化，不利于继代扩繁培养。因此，以细胞分裂素6-BA浓度为0.3 mg/L时，有利于外植体初始始芽的诱导，不仅有85%较高的诱导率，而且每丛芽有2～3个单芽，芽生长健壮。endprint

2.2 外源激素组合对芽增殖培养的影响

在植物组织培养过程中，始芽的分化不仅要有较高的增殖系数，同时始芽还必须是生长健壮，才能达到组培快繁的要求[5]。以细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA为外源激素，将红锥芽转接在9种不同浓度梯度组合进行继代培养，观察统计平均在一个培养继代周期内始芽的分化增殖系数和及其生长情况，结果见表3。

激素不同种类，不同浓度对芽的增殖和生长有不用的效果，经试验表明，6-BA浓度对芽增殖培养影响最大，NAA浓度次之，KT浓度影响最小。增殖率的变化规律是：从细胞分裂素6-BA来看，当细胞分裂素6-BA的浓度为较低0.2 mg/L时，芽在继代培养30 d时，平均增殖率为2.41%，芽长势较弱，表现出叶尖卷曲，部分顶芽变黄，而当浓度增加到0.3 mg/L时，芽的增殖系数也相应提高，达到最高的3.58，而且芽生长健壮，叶色绿，但当浓度增加较高为0.4 mg/L时，芽的增殖率有所下降，芽的生长质量也呈下降趋势，表现出叶卷曲，芽粗短呈玻璃化；从生长素NAA来看，在3种与细胞分裂素6-BA不同组合中，浓度为0.5 mg/L时，平均增殖率最高，浓度过高或过低都不利于增殖率的提高；从细胞分裂素KT来看，在培养基中加入KT后，芽的增殖率反而出现下降，说明KT的加入不利于红锥芽增殖培养。因此，红锥在继代培养时适宜芽增殖和生长的最佳外源激素组合为BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

2.3 单芽生根诱导培养

在植物离体培养过程中，单芽生根率的高低是影响无性快繁速度的主要因子之一，生长素类物质的合理应用对生根起着至关重要的促进作用[6]。将生长健壮、叶片舒展的芽丛分割并切成单芽呈直插式接种，以BMT基本培养基、IAA和IBA二种不同生长素共9个处理，进行正交生根诱导试验。每个试验处理接种8瓶，每瓶25株共200株，培养30 d时统计生根率，正交试验结果见表4，方差分析见表5。

在生长素IBA、IAA 与基本培养基组成的L9（34）正交生根试验中，3个试验因素R值大小次序为：IBA>基本培养基>IAA，这与方差分析的结果一致。在0.05水平上，IBA对红锥始芽的生根起了显著作用，不同水平间的IBA对始芽的生根差异显著，基本培养基和IAA对红锥始芽的生根没有显著作用。一般认为IBA能够促进根系条数增加，红锥始芽对IBA敏感，对始芽生长起了显著作用。筛选出最佳的生根培养基为1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L，生根率高达82%，且根系较多，再生植株生长健壮。

2.4 植株的移栽

将组培生根瓶苗搬出培养室移至大棚于自然环境下练苗5～7 d，移栽前对移栽基质进行消毒处理，提前一天用0.2%～0.3%高锰酸钾溶液消毒基质，移栽当天用自来水浇透基质，除去基质中残留的高锰酸钾，用清水漂洗干净根部粘附的培养基。移栽试验结果表明：红心土的移栽效果最好。移栽后后要淋水保湿，保持移栽苗水分的平衡，防止移栽苗萎蔫而死。用遮光度为75%的黑网挡阳以避免太阳直射，注意苗床的通风透气，移栽后可适当喷施一定浓度的叶面肥，使用这种方法移栽成活率在90%以上。

3 小结与讨论

3.1 培养基的选择

选择适宜的培养基对组织培养成功与否至关重要，红锥适宜的基本培养基为BMT。分析认为，BMT培养基内含有较高的Ca2+离子，Ca2+浓度能促进植物体内糖分的运输，说明高浓度的钙元素更加有利于红锥芽的器官分化和生长。这一点与王以红等[5]对壳斗科植物大叶栎组织培养选用的培养基的研究结果相一致。

3.2 芽增殖和生长

以BMT为基本培养基，添加细胞分裂素6-BA 0.3 mg/L和生长素NAA 0.5 mg/L，可作为红锥芽扩繁培养的最佳培养基。将红锥的芽以水平向接种于培养基上，培养前期在较弱的光照下，光照强度控制在1 000 lx左右，后期移置于3 000 lx较强的光照强度下生长，继代培养周期保持在30 d左右，进行芽的分化、增殖和生长等扩繁培养，继代芽可以3.58/30 d的增殖系数达到扩大繁殖目的。在红锥芽增殖和生长的过程中，随着继代次数的增加，培养材料会出现褐化现象，在转接的时候将芽基部老化材料剪切后再接到新鲜的培养基上，能在一定程度上克服褐化现象的发现，但是褐化问题的根源有待进一步研究。

3.3 单芽生根培养

可以1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L作为红锥单芽生根培养的最佳培养基，在继代芽中选择生长健壮的单芽切割后接种，进行根系诱导培养。培养6 d时单芽基部开始长出根点，培养15 d时根系生长至1～1.5 cm长，形成完整的再生植株，生根率达到82%。本研究发现，单芽生根诱导与继代芽的质量有很强的相关性，生长健壮、叶片舒展、叶色浓绿的继代芽则生根率高，且根系发达，因此在进行单芽生根诱导前，必须使继代芽得到充分的光照，以增强光合作用促进始芽的健壮生长。

本研究所建立的红锥组织培养再生繁殖体系，为红锥优良苗木的培育提供了一定的科学依据。

参考文献

[1] 刘庆昌，吴国良. 植物细胞组织培养[M]. 北京：中国农业大学出版社，2002.

[2] 盖钧镒. 试验统计方法[M]. 北京：中国农业出版社，2000.

[3] 朱积余，蒋 燚，丘小军. 广西红锥地理种源试验初报[J]. 广西林业科学，1997，26（2）：66-68.

[4] 朱积余，蒋 燚，潘 文. 广西红锥优树选择标准研究[J]. 广西林业科学，2002，9（3）：109-113.

[5] 王以红，陈晓明，蔡 玲，等. 大叶栎组织培养再生植株的研究[J]. 广西林业科学， 2009，38（2）：71-74.

[6] 吴幼媚，王以红，蔡 玲，等. 香樟优良无性系快繁技术的研究[J]. 广西农业生物科学，2006，25（1）：60-64.endprint

2.2 外源激素组合对芽增殖培养的影响

在植物组织培养过程中，始芽的分化不仅要有较高的增殖系数，同时始芽还必须是生长健壮，才能达到组培快繁的要求[5]。以细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA为外源激素，将红锥芽转接在9种不同浓度梯度组合进行继代培养，观察统计平均在一个培养继代周期内始芽的分化增殖系数和及其生长情况，结果见表3。

激素不同种类，不同浓度对芽的增殖和生长有不用的效果，经试验表明，6-BA浓度对芽增殖培养影响最大，NAA浓度次之，KT浓度影响最小。增殖率的变化规律是：从细胞分裂素6-BA来看，当细胞分裂素6-BA的浓度为较低0.2 mg/L时，芽在继代培养30 d时，平均增殖率为2.41%，芽长势较弱，表现出叶尖卷曲，部分顶芽变黄，而当浓度增加到0.3 mg/L时，芽的增殖系数也相应提高，达到最高的3.58，而且芽生长健壮，叶色绿，但当浓度增加较高为0.4 mg/L时，芽的增殖率有所下降，芽的生长质量也呈下降趋势，表现出叶卷曲，芽粗短呈玻璃化；从生长素NAA来看，在3种与细胞分裂素6-BA不同组合中，浓度为0.5 mg/L时，平均增殖率最高，浓度过高或过低都不利于增殖率的提高；从细胞分裂素KT来看，在培养基中加入KT后，芽的增殖率反而出现下降，说明KT的加入不利于红锥芽增殖培养。因此，红锥在继代培养时适宜芽增殖和生长的最佳外源激素组合为BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

2.3 单芽生根诱导培养

在植物离体培养过程中，单芽生根率的高低是影响无性快繁速度的主要因子之一，生长素类物质的合理应用对生根起着至关重要的促进作用[6]。将生长健壮、叶片舒展的芽丛分割并切成单芽呈直插式接种，以BMT基本培养基、IAA和IBA二种不同生长素共9个处理，进行正交生根诱导试验。每个试验处理接种8瓶，每瓶25株共200株，培养30 d时统计生根率，正交试验结果见表4，方差分析见表5。

在生长素IBA、IAA 与基本培养基组成的L9（34）正交生根试验中，3个试验因素R值大小次序为：IBA>基本培养基>IAA，这与方差分析的结果一致。在0.05水平上，IBA对红锥始芽的生根起了显著作用，不同水平间的IBA对始芽的生根差异显著，基本培养基和IAA对红锥始芽的生根没有显著作用。一般认为IBA能够促进根系条数增加，红锥始芽对IBA敏感，对始芽生长起了显著作用。筛选出最佳的生根培养基为1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L，生根率高达82%，且根系较多，再生植株生长健壮。

2.4 植株的移栽

将组培生根瓶苗搬出培养室移至大棚于自然环境下练苗5～7 d，移栽前对移栽基质进行消毒处理，提前一天用0.2%～0.3%高锰酸钾溶液消毒基质，移栽当天用自来水浇透基质，除去基质中残留的高锰酸钾，用清水漂洗干净根部粘附的培养基。移栽试验结果表明：红心土的移栽效果最好。移栽后后要淋水保湿，保持移栽苗水分的平衡，防止移栽苗萎蔫而死。用遮光度为75%的黑网挡阳以避免太阳直射，注意苗床的通风透气，移栽后可适当喷施一定浓度的叶面肥，使用这种方法移栽成活率在90%以上。

3 小结与讨论

3.1 培养基的选择

选择适宜的培养基对组织培养成功与否至关重要，红锥适宜的基本培养基为BMT。分析认为，BMT培养基内含有较高的Ca2+离子，Ca2+浓度能促进植物体内糖分的运输，说明高浓度的钙元素更加有利于红锥芽的器官分化和生长。这一点与王以红等[5]对壳斗科植物大叶栎组织培养选用的培养基的研究结果相一致。

3.2 芽增殖和生长

以BMT为基本培养基，添加细胞分裂素6-BA 0.3 mg/L和生长素NAA 0.5 mg/L，可作为红锥芽扩繁培养的最佳培养基。将红锥的芽以水平向接种于培养基上，培养前期在较弱的光照下，光照强度控制在1 000 lx左右，后期移置于3 000 lx较强的光照强度下生长，继代培养周期保持在30 d左右，进行芽的分化、增殖和生长等扩繁培养，继代芽可以3.58/30 d的增殖系数达到扩大繁殖目的。在红锥芽增殖和生长的过程中，随着继代次数的增加，培养材料会出现褐化现象，在转接的时候将芽基部老化材料剪切后再接到新鲜的培养基上，能在一定程度上克服褐化现象的发现，但是褐化问题的根源有待进一步研究。

3.3 单芽生根培养

可以1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L作为红锥单芽生根培养的最佳培养基，在继代芽中选择生长健壮的单芽切割后接种，进行根系诱导培养。培养6 d时单芽基部开始长出根点，培养15 d时根系生长至1～1.5 cm长，形成完整的再生植株，生根率达到82%。本研究发现，单芽生根诱导与继代芽的质量有很强的相关性，生长健壮、叶片舒展、叶色浓绿的继代芽则生根率高，且根系发达，因此在进行单芽生根诱导前，必须使继代芽得到充分的光照，以增强光合作用促进始芽的健壮生长。

本研究所建立的红锥组织培养再生繁殖体系，为红锥优良苗木的培育提供了一定的科学依据。

参考文献

[1] 刘庆昌，吴国良. 植物细胞组织培养[M]. 北京：中国农业大学出版社，2002.

[2] 盖钧镒. 试验统计方法[M]. 北京：中国农业出版社，2000.

[3] 朱积余，蒋 燚，丘小军. 广西红锥地理种源试验初报[J]. 广西林业科学，1997，26（2）：66-68.

[4] 朱积余，蒋 燚，潘 文. 广西红锥优树选择标准研究[J]. 广西林业科学，2002，9（3）：109-113.

[5] 王以红，陈晓明，蔡 玲，等. 大叶栎组织培养再生植株的研究[J]. 广西林业科学， 2009，38（2）：71-74.

[6] 吴幼媚，王以红，蔡 玲，等. 香樟优良无性系快繁技术的研究[J]. 广西农业生物科学，2006，25（1）：60-64.endprint

2.2 外源激素组合对芽增殖培养的影响

在植物组织培养过程中，始芽的分化不仅要有较高的增殖系数，同时始芽还必须是生长健壮，才能达到组培快繁的要求[5]。以细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA为外源激素，将红锥芽转接在9种不同浓度梯度组合进行继代培养，观察统计平均在一个培养继代周期内始芽的分化增殖系数和及其生长情况，结果见表3。

激素不同种类，不同浓度对芽的增殖和生长有不用的效果，经试验表明，6-BA浓度对芽增殖培养影响最大，NAA浓度次之，KT浓度影响最小。增殖率的变化规律是：从细胞分裂素6-BA来看，当细胞分裂素6-BA的浓度为较低0.2 mg/L时，芽在继代培养30 d时，平均增殖率为2.41%，芽长势较弱，表现出叶尖卷曲，部分顶芽变黄，而当浓度增加到0.3 mg/L时，芽的增殖系数也相应提高，达到最高的3.58，而且芽生长健壮，叶色绿，但当浓度增加较高为0.4 mg/L时，芽的增殖率有所下降，芽的生长质量也呈下降趋势，表现出叶卷曲，芽粗短呈玻璃化；从生长素NAA来看，在3种与细胞分裂素6-BA不同组合中，浓度为0.5 mg/L时，平均增殖率最高，浓度过高或过低都不利于增殖率的提高；从细胞分裂素KT来看，在培养基中加入KT后，芽的增殖率反而出现下降，说明KT的加入不利于红锥芽增殖培养。因此，红锥在继代培养时适宜芽增殖和生长的最佳外源激素组合为BMT+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

2.3 单芽生根诱导培养

在植物离体培养过程中，单芽生根率的高低是影响无性快繁速度的主要因子之一，生长素类物质的合理应用对生根起着至关重要的促进作用[6]。将生长健壮、叶片舒展的芽丛分割并切成单芽呈直插式接种，以BMT基本培养基、IAA和IBA二种不同生长素共9个处理，进行正交生根诱导试验。每个试验处理接种8瓶，每瓶25株共200株，培养30 d时统计生根率，正交试验结果见表4，方差分析见表5。

在生长素IBA、IAA 与基本培养基组成的L9（34）正交生根试验中，3个试验因素R值大小次序为：IBA>基本培养基>IAA，这与方差分析的结果一致。在0.05水平上，IBA对红锥始芽的生根起了显著作用，不同水平间的IBA对始芽的生根差异显著，基本培养基和IAA对红锥始芽的生根没有显著作用。一般认为IBA能够促进根系条数增加，红锥始芽对IBA敏感，对始芽生长起了显著作用。筛选出最佳的生根培养基为1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L，生根率高达82%，且根系较多，再生植株生长健壮。

2.4 植株的移栽

将组培生根瓶苗搬出培养室移至大棚于自然环境下练苗5～7 d，移栽前对移栽基质进行消毒处理，提前一天用0.2%～0.3%高锰酸钾溶液消毒基质，移栽当天用自来水浇透基质，除去基质中残留的高锰酸钾，用清水漂洗干净根部粘附的培养基。移栽试验结果表明：红心土的移栽效果最好。移栽后后要淋水保湿，保持移栽苗水分的平衡，防止移栽苗萎蔫而死。用遮光度为75%的黑网挡阳以避免太阳直射，注意苗床的通风透气，移栽后可适当喷施一定浓度的叶面肥，使用这种方法移栽成活率在90%以上。

3 小结与讨论

3.1 培养基的选择

选择适宜的培养基对组织培养成功与否至关重要，红锥适宜的基本培养基为BMT。分析认为，BMT培养基内含有较高的Ca2+离子，Ca2+浓度能促进植物体内糖分的运输，说明高浓度的钙元素更加有利于红锥芽的器官分化和生长。这一点与王以红等[5]对壳斗科植物大叶栎组织培养选用的培养基的研究结果相一致。

3.2 芽增殖和生长

以BMT为基本培养基，添加细胞分裂素6-BA 0.3 mg/L和生长素NAA 0.5 mg/L，可作为红锥芽扩繁培养的最佳培养基。将红锥的芽以水平向接种于培养基上，培养前期在较弱的光照下，光照强度控制在1 000 lx左右，后期移置于3 000 lx较强的光照强度下生长，继代培养周期保持在30 d左右，进行芽的分化、增殖和生长等扩繁培养，继代芽可以3.58/30 d的增殖系数达到扩大繁殖目的。在红锥芽增殖和生长的过程中，随着继代次数的增加，培养材料会出现褐化现象，在转接的时候将芽基部老化材料剪切后再接到新鲜的培养基上，能在一定程度上克服褐化现象的发现，但是褐化问题的根源有待进一步研究。

3.3 单芽生根培养

可以1/2 BMT+IBA 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L作为红锥单芽生根培养的最佳培养基，在继代芽中选择生长健壮的单芽切割后接种，进行根系诱导培养。培养6 d时单芽基部开始长出根点，培养15 d时根系生长至1～1.5 cm长，形成完整的再生植株，生根率达到82%。本研究发现，单芽生根诱导与继代芽的质量有很强的相关性，生长健壮、叶片舒展、叶色浓绿的继代芽则生根率高，且根系发达，因此在进行单芽生根诱导前，必须使继代芽得到充分的光照，以增强光合作用促进始芽的健壮生长。

本研究所建立的红锥组织培养再生繁殖体系，为红锥优良苗木的培育提供了一定的科学依据。

参考文献

[1] 刘庆昌，吴国良. 植物细胞组织培养[M]. 北京：中国农业大学出版社，2002.

[2] 盖钧镒. 试验统计方法[M]. 北京：中国农业出版社，2000.

[3] 朱积余，蒋 燚，丘小军. 广西红锥地理种源试验初报[J]. 广西林业科学，1997，26（2）：66-68.

[4] 朱积余，蒋 燚，潘 文. 广西红锥优树选择标准研究[J]. 广西林业科学，2002，9（3）：109-113.

[5] 王以红，陈晓明，蔡 玲，等. 大叶栎组织培养再生植株的研究[J]. 广西林业科学， 2009，38（2）：71-74.

[6] 吴幼媚，王以红，蔡 玲，等. 香樟优良无性系快繁技术的研究[J]. 广西农业生物科学，2006，25（1）：60-64.endprint