HPLC法测定大鼠肝微粒体中UGT酶的底物

洪丽霞,吕红霞,石明芯,王佳慧,代晶(成都医学院药学院,成都 610083)

·论 著·

HPLC法测定大鼠肝微粒体中UGT酶的底物

洪丽霞,吕红霞,石明芯,王佳慧,代晶*
(成都医学院药学院,成都 610083)

目的 建立测定大鼠肝微粒中UGT酶底物的HPLC方法。方法 选择对硝基酚、对乙酰氨基酚作为UGT的特异性底物。采用高效液相色谱法,分别以非那西丁、咖啡因作为内标,色谱柱为 Welchrom C18,体积流量为1 mL/min,柱温为30 ℃。对硝基酚和对乙酰氨基酚的流动相分别为乙腈-0.01 mol/L的醋酸铵缓冲液(pH 5.00)=35∶65和乙腈-水=14∶86, 对应的检测波长分别为316 nm和244 nm。 结果 对硝基酚和对乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范围内,线性关系良好。对硝基酚的日内精密度和日间精密度RSD%﹤14.7%,方法回收率为89.9%～111.0%,提取回收率>86.5%。对乙酰氨基酚的日内精密度和日间精密度RSD%﹤13.0%,方法回收率105.6% ～114.2%,提取回收率>78.3%。结论 两组方法灵敏、简便、准确,可用于大鼠肝微粒体中UGT酶活性的测定。

高效液相色谱法；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶；对硝基酚；对乙酰氨基酚；肝微粒体

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT) 是生物体内重要的Ⅱ相代谢酶,其主要作用是催化内源及外源化合物进行葡萄糖醛酸结合反应,增加其极性,便于随尿及胆汁排出体外。 UGT广泛分布于肾脏、脑、皮肤、肠、脾、胸腺、心脏等组织,其中以肝脏中该酶的活性最高[1]。在药物的Ⅱ相代谢反应中,这种反应占到35%[2],因此研究药物与UGT 酶的关系,对药物相互作用、解毒排毒机制的研究具有十分重要的意义。本文选择对硝基酚、对乙酰氨基酚为UGT底物[3,4], 建立测定大鼠肝微粒体中UGT酶底物的HPLC法。该方法简单、灵敏度高、准确度好,可为UGT酶活性的测定提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料

非那西丁和对乙酰氨基酚(中国药品生物制品检定所,批号分别为100095-198904、100018-200408),对硝基酚(成都科龙化工试剂厂,批号：070608),色谱纯乙腈(美国Dikma公司),其余试剂均为分析纯。高效液相色谱仪(美国戴安公司),包括P680泵、ASI-100自动进样器、UV1700型检测器、TC100柱温箱和Chromeleon工作站。SD大鼠10只(雄性,体质量250±20 g)购自四川大学华西实验动物中心,合格证号:SYXK(川)2008-113。

1.2 溶液的配制

取非那西丁和咖啡因对照品适量,精密称定,用甲醇溶解稀释配制成0.5 mmol/L的对照品溶液。分别取对硝基酚、对乙酰氨基酚适量,精密称定,用甲醇稀释配制成10 mmol/L的贮备液,再用甲醇稀释浓度为1 000、500、200、100、50、20、10、5 μmol/L的系列标准溶液。上述溶液置于4 ℃冰箱中保存,备用。

1.3 肝微粒体的制备与测定

[5]制备大鼠肝微粒,并测定蛋白浓度。

1.4 样品前处理方法

分别取对硝基酚和对乙酰氨基酚对照品溶液50 μL,挥干溶剂,加入肝微粒体和0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)缓冲液,使溶液的终体积为0.5 mL,蛋白的终浓度为0.5 g/L。再加入乙酸乙酯2.0 mL,内标溶液50 μL,涡旋萃取3.0 min,取有机层挥干溶剂,残渣用0.1 mL流动相溶解,取20 μL进样分析。

1.5 色谱条件

色谱柱为Welchrom C18柱(250×4.6 mm,5 μm),柱温为30 ℃,体积流量为1.0 mL/min。对硝基酚的流动相为乙腈-0.01mol/L的醋酸铵缓冲液(pH5.0)(35∶65),检测波长为316 nm；对乙酰氨基酚的流动相为乙腈-水(14∶86),检测波长为244 nm。两组柱温均为30 °C,流速为1.0 mL/min。

1.6 分析方法的验证

试验对两组HPLC法进行了系统适用性、线性、定量下限、精密度、回收率和稳定性的验证。

2 结果

2.1 系统适用性试验

分别取空白肝微粒体、空白肝微粒体加对硝基酚和非那西丁,空白肝微粒体加对乙酰氨基酚和咖啡因,参照“1.4”和“1.5”项方法处理和分析样品。在此条件下,非那西丁和对硝基酚的保留时间分别为7.8 min和10.4 min,理论塔板数均大于13 000；对乙酰氨基酚和咖啡因的保留时间分别为5.8 min和8.5 min,理论塔板数均大于11 000。两组方法中各成分达基线分离,内源性物质无干扰(见图1)。

2.2 标准曲线的绘制

分别取对硝基酚和对乙酰氨基酚系列标准溶液各50 μL,挥干溶剂后,加入肝微粒溶液,每个浓度样品一式3份,参照“1.4”和“1.5”项方法处理和分析样品。以各底物峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标(Y),以各底物浓度作为横坐标(X)进行线性回归。同时以信噪比≥10计算定量下限(LLOQ)。结果显示:对硝基酚和对乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范围内线性关系良好,回归方程分别是Y=0.0107X+0.0055和Y=0.0216X+0.0042；相关系数依次是0.9999和0.9993；LLOQ均为0.5 μmol/L。

2.3 精密度和回收率试验

制备高、中、低3个浓度的对硝基酚、对乙酰氨基酚质控样品,每一浓度平行制备5份,参照“1.4”和“1.5”项方法,1 d内进样分析,记录色谱,计算日内精密度,连续测定3 d,计算日间精密度。将检测得到的底物与内标峰面积之比代入回归方程,计算方法回收率。再取同等浓度的各底物和内标对照品溶液,直接挥干溶剂,流动相溶解后进样分析,记录色谱,将肝微粒体内的底物的标峰面积与对照峰面积进行比较,计算提取回收率(见表1)。

表1 精密度和回收率试验结果(n=5)

2.4 稳定性试验

分别将低、中、高3个浓度的对硝基酚、对乙酰氨基酚质控样品置于室温和-20 ℃冰箱中保存。置于室温的样品分别于24 h和48 h后进行测定。置于-20 ℃冰箱中的样品分别于3 d和7 d后测定。结果显示:置于室温的对硝基酚和对乙酰氨基酚的测定结果RSD%<3.2%和RSD<4.8%；置于冰箱的测定结果RSD%<7.6%和RSD%<9.3%。表明两组质控样品在室温48 h内稳定,在-20 ℃冰箱7 d内稳定。

图1 HPLC图A.对硝基酚组的空白肝微粒体;B. 空白肝微粒体加对硝基酚和非那西丁;C. 对乙酰氨基酚组的空白肝微粒体;D. 空白肝微粒体加对乙酰氨基酚和咖啡因1. 非那西丁(内标)；2. 对硝基酚; 3. 对乙酰氨基酚； 4. 咖啡因(内标)

3 讨论

本试验对色谱条件进行了筛选,比较了甲醇、乙腈和不同pH缓冲溶液的洗脱效果。结果发现：乙腈的洗脱能力较强,对硝基酚在pH5.0溶液、对乙酰氨基酚在水溶液中可以得到满意的分离效果。试验还比较了乙腈直接沉淀蛋白、氯仿-乙酸乙酯(3∶2)萃取、乙醚萃取、乙酸乙酯萃取几种前处理方法。结果显示：氯仿-乙酸乙酯和乙醚的提取率很低(<50%),而乙腈和乙酸乙酯提取率较高。考虑到经乙酸乙酯萃取,体系中的杂质较少,去除蛋白效果好,故选择乙酸乙酯作为提取试剂。

目前UGT酶活性的测定方法主要有放射检测法、紫外法、荧光法和LC-MS法等。放射检测法以14C-二磷酸尿苷葡萄糖醛酸作为酶底物, 以放射自显影术测定酶活性,该方法底物较为昂贵,测定周期长,技术不易普及[6]；紫外法主要以2-氨基酚为底物,利用重氮化偶合反应测定UGT总酶的活性,该方法操作过程极为烦琐,且检测准确度较低[7]；荧光法主要以荧光试剂作为底物(如对羟基联苯、7-羟基-4-甲基香豆素),方法虽然简单,但易受干扰[8,9]；有学者[10]以丙泊酚为底物,利用LC-MS法测定UGT1A9酶活性,该法灵敏度高、准确性和专属性较好,但丙泊酚是一种静脉麻醉药,属于管制药品,不易获得。与其他方法相比,本试验选择的UGT底物是常见的化学试剂,廉价、易获得,其葡萄糖醛酸化反应专属性较好。两组方法前处理简单、测定技术普及率高、方法灵敏、定量准确、专属性好,故可以为UGT酶活性测定提供有效的分析方法。

参考文献

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Determination of UGT Substrates in Rats' Liver Microsomes by HPLC

HONGLi-xia,LVHong-xia,SHIMing-xin,WANGJia-hui,DAIJing*

(SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

Objective To establish a HPLC method for the determination of UGT substrates in isolated rat liver microsomes. Methods P-nitrophenol and acetaminophen were chosen as UGT substrates, with phenacetin and caffeine as internal standards, respectively. The determination was performed on a Welchrom C18 column, with mobile phase of p-nitrophenol was acetonitrile-0.01mol/L ammonium acetate (pH 5.00=35∶65，and for acetaminophen was acetonitrile -water=14∶86. The flow rate was 1 mL/min. Detection wavelength of p-nitrophenol and acetaminophen were set at 316 nm and 244 nm. The column temperature was 30 ℃, and injection volume was 20 μL. Results The linear ranges of p-nitrophenol and acetaminophen were 0.5-100 μmol/L. The intra-and inter-assay precisions of p-nitrophenol were less than 14.7%，the assay recoveries were between 89.9% and 111.0%, and the extract recoveries were greater than 86.5%. For acetaminophen, the intra-and inter-assay precisions were less than 13.0%, the method recoveries were between 105.6% and 114.2%, and extraction recovery was greater than 78.3%. Conclusion The two methods were sensitive, simple and accurate. which can be applied for determination of UGT enzyme activity in isolated rat liver microsome.

HPLC; Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase; P-Nitrophenol; Acetaminophen; Liver Microsomes

国家级大学生创新创业训练计划项目(NO：20133705006)；四川省教育厅理科重点项目(NO：12ZA026)；成都医学院大学生创新性实验项目(NO：CX201103)

代晶,E-mail：daijing320@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140417.1420.003.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.003

R969.2

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