缺血后处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤内质网应激通路相关分子的影响

刘 楠， 于雪凡， 李 岩， 牛振华

脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)损伤是急性脑梗死血栓再通后的一种常见的病理生理现象，可以引起一系列级联反应，包括钙离子稳态破坏、兴奋性毒性氨基酸产生、氧化应激、线粒体功能障碍等，最终导致细胞坏死或凋亡。研究证明，内质网应激在脑缺血/再灌注损伤导致的神经细胞凋亡中发挥重要作用［1］。缺血后处理(ischemic postconditioning)是指在再灌注早期，重复给予几次短暂的的非致死性的血管闭塞与再通的过程［2］，被认为是一种缺血/缺氧耐受现象。缺血后处理脑保护作用逐渐为人们所认识，但其机制尚不完全清楚。Hayashi等人的研究发现，脑缺血预处理可以激活适当的内质网应激，增强内质网处理未折叠蛋白反应(UPR)的能力，促进内质网功能的恢复，延缓和减轻缺血/再灌注造成的组织损伤［3］。缺血后处理是否也可以通过减弱内质网应激(ERS)从而发挥神经保护作用，目前国内外研究较少［4］。本研究从ERS角度探讨缺血后处理在大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤中的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备 动物分组:清洁级健康成年雄性Wistar大鼠58只，体重240～280 g，由吉林大学白求恩基础医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组(sham组 n=6)、缺血/再灌注组(I/R组n=26)和缺血后处理组(IP组n=26)。后两组依据再灌注时间不同再分为6 h、12 h、24 h 3个亚组。

改良Longa［5］线栓法制备左侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型:大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈部正中切口，延左侧胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)并挂线备用，结扎CCA和ECA，在颈外动脉剪一小口，将制备好的线栓插入ECA经CCA分叉处进入ICA，通过大脑中动脉起始端至大脑前动脉近端(插入深度平均约18.5±0.5 mm)，直至稍感阻力，扎紧备线，固定线栓。缺血2 h后拔出线栓实施再灌注6 h、12 h、24 h。假手术组仅暴露CCA、ECA及ICA，不做插线处理。缺血后处理组实施方法为缺血2h后将线栓拔至 CCA分叉处，实现再灌 10 min，后再次行MCAO 10 min，随后分别实现再灌注 6 h、12 h、24 h。所有实验动物均术前禁食12 h，不禁水，术中及术后维持肛温在37℃，术后单笼饲养。

1.2 神经行为学评分 脑缺血2 h再灌注24 h，由不知分组情况的观察者根据Zea Longa 6级5分制评分法［5］对大鼠进行评分。评分标准:0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识丧失;5分:死亡。其中评分为1～3分且无蛛网膜下腔出血的大鼠纳入分组，0分、4分和5分剔除，并随机补充。

1.3 脑梗死体积测定 脑缺血2 h再灌注24 h后，将大鼠麻醉，迅速断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，于-20℃冰箱中速冻15 min，沿着冠状切面切成6片，每片厚度约2 mm，将脑片放入2%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液中，37 ℃避光染色30 min，正常脑组织染成红色，梗死灶成白色。将脑片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，数码相机拍照，应用Image J图像分析软件计算脑片梗死面积。根据公式V=(A1+～+An)t算出梗死体积，其中t为切片厚度，A为梗死面积。结果以梗死体积占缺血侧总体积的百分比表示。梗死体积百分比(%)=梗死体积/缺血侧总体积×100%［6］。

1.4 免疫组化标本取材与制备 大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉，打开胸腔，先后用生理盐水和4%多聚甲醛行心脏灌流，断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定24 h。于视交叉后1.7～4.0 mm冠状切片，取中间切块逐级脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋制作石蜡标本，保存于4℃冰箱中备用。

1.5 免疫组化检测GRP78、caspase-12蛋白表达 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司(PV-6000)，严格按照说明书进行操作。一抗(Abcam公司)工作浓度1∶50。DAB显色后苏木素轻度复染。常规封片，镜下进行定性观察(图1A箭头所示为观察部位)。判断标准:镜下胞质或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。在10×40倍光镜下每张切片随机选5个不重复视野进行拍照，应用Image pro plus图像分析软件计数各指标的阳性细胞数。阳性细胞率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分比较 假手术组无神经系统损害，评分为0;后处理组神经缺损程度明显减轻，低于缺血/再灌注组，差异有统计学意义(t=4.304，P=0.000)(见图1B)。

2.2 脑梗死体积百分比的比较 假手术组脑组织呈均匀红色，无梗死灶;与缺血/再灌注组相比，后处理组梗死体积减小，差异有统计学意义(t=5.559，P=0.000)(见图1C、图 1D)。

2.3 免疫组化检测GRP78、caspase-12蛋白表达 Sham组缺血半暗带GRP78、caspase-12阳性细胞仅少量表达。与sham组相比，I/R组再灌注后6 h、12 h、24 h GRP78、caspase-12 阳性细胞数量明显增加，GRP78于再灌注后12 h达高峰，caspase-12于再灌注后24 h达高峰，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与 I/R 组相比，Ipost组再灌注 12 h、24 h GRP78阳性细胞数量明显增加(见图2)，再灌注后24 h caspase-12阳性细胞数量明显减少(见图3)，差异均有统计学意义(P＜0.05)(见表1、表2)。

表1 脑组织缺血半暗带内GRP78蛋白阳性细胞率的比较(，n=6)

表1 脑组织缺血半暗带内GRP78蛋白阳性细胞率的比较(，n=6)

与假手术组相比*P＜0.05;与缺血再灌注组相比#P＜0.05

组别 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手术组脑缺血/再灌注组脑缺血后处理组40.17 ±5.04*47.83 ±7.52 55.33 ±8.71*66.17 ±7.31#6.50 ±2.74 45.00 ±9.84*61.17 ±13.11#

表2 脑组织缺血半暗带内caspase-12蛋白阳性细胞率的比较(，n=6)

表2 脑组织缺血半暗带内caspase-12蛋白阳性细胞率的比较(，n=6)

与假手术组相比*P＜0.05;与缺血再灌注组相比#P＜0.05

组别 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手术组脑缺血/再灌注组脑缺血后处理组26.00 ±7.56*23.33 ±6.86 33.83 ±5.67*26.83 ±7.52 7.17 ±3.37 53.67 ±6.77*39.00 ±14.35#

图1 大鼠脑缺血2 h再灌注24 h神经行为学评分与脑梗死体积

图2 GRP78免疫组化染色

图3 Caspase-12免疫组化染色

3 讨论

脑缺血/再灌注损伤主要是指缺血脑组织恢复血液灌注后，脑组织损伤反而加重，导致缺血及周边区域神经细胞坏死和凋亡。在局灶性脑缺血/再灌注损伤中，位于缺血中心区的神经细胞多发生坏死，无法再生，而缺血周边区即半暗带的损伤相对较轻，该区域的神经细胞多表现为凋亡。因此，挽救缺血半暗带的神经细胞就成为脑梗死治疗的重点。缺血后处理是指在再灌注早期进行短暂的、一次或多次亚致死性血管闭塞与再通［2，7］。脑缺血后处理可以减少梗死体积，抑制神经细胞凋亡，具有神经保护作用［8～10］。自缺血后处理的概念被提出后，关于其治疗时间窗、再灌注/缺血循环次数、循环时程、潜在的保护机制等，仍无统一定论。本研究采用Pignataro等［8］的再灌注10 min/缺血10 min的后处理操作，结果显示缺血后处理组脑梗死体积较缺血/再灌注组明显减低，且神经功能缺损程度明显改善，可见此后处理方法对大鼠脑缺血/再灌注损伤有保护作用。

内质网是真核细胞中重要的细胞器，它由封闭的膜系统及其围成的腔形成互相沟通的网状结构，对细胞正常功能的维持至关重要［11］。内质网在调节膜蛋白、分泌蛋白的折叠与加工、钙的储存与释放方面具有重要的作用［12］。研究表明，脑缺血/再灌注可以引起内质网固有蛋白折叠或加工过程受阻、钙离子稳态被打破，导致内质网功能障碍，从而触发ERS［1］。目前认为，ERS介导的神经细胞凋亡在缺血性脑卒中病理生理学机制中发挥重要作用［12，13］。GRP78属于热休克蛋白70(HSP70)家族一员［14］，同时也是内质网重要的分子伴侣［15］。生理状态下，GRP78分别与 PERK、IRE1α、ATF6(感受内质网应激信号的3种跨膜蛋白)暴露于ER腔中的结构域结合，处于非活化状态。内质网功能障碍时，未折叠蛋白大量聚集，GRP78便与 PERK、IRE1α、ATF6解离，转而与未折叠蛋白结合，由此促进蛋白质的正确折叠。ERS是细胞的一种自我保护机制，以恢复内质网内环境稳态，但是严重且持续时间较长的ERS将最终导致神经细胞凋亡。Caspase-12定位于ER外膜，是介导ERS凋亡的关键分子，在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可诱导其发生凋亡，表明caspase-12与ERS介导凋亡的机制有关，而与非ERS介导的凋亡无关［16］。生理情况下，caspase-12以无活性的酶原形式存在，ERS状态下，caspase-12酶原特异性激活，进而激活下游caspase-9、caspase-3 级联反应，介导细胞凋亡［17］。

本研究结果显示，脑缺血2 h再灌注6 h缺血半暗带GRP78、caspase-12蛋白表达开始增加，GRP78于再灌注后12 h达高峰，caspase-12于再灌注后24 h达高峰，与 Shibata等［18］的报道一致。与缺血再灌注组相比，缺血后处理组再灌注后12 h、24 h GRP78蛋白表达明显增加，再灌注后24 h caspase-12蛋白表达明显减少。上述发现说明，脑缺血/再灌注损伤启动了内质网应激反应，诱导了GRP78和caspase-12的表达。缺血后处理组上调了内质网应激蛋白GRP78的表达，减弱了caspase-12的表达。因此缺血后处理可以通过减弱内质网应激从而发挥神经保护作用，抑制神经细胞凋亡。

综上所述，缺血后处理可明显改善大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤所致的神经功能缺损症状，并减少脑梗死体积，具有神经保护作用。其机制可能与上调GRP78的表达、抑制caspase-12的表达相关。说明脑缺血后处理可能通过减弱内质网应激过程从而对随后发生的再灌注损伤起到了神经保护作用。

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