骨髓间质干细胞贴壁筛选法的提纯

任瑞芳， 黄良国， 黄名璐， 蒋国红， 白 洁

骨髓间质干细胞(mesenchymaI stem cells，MSCs)是骨髓细胞中的粘附细胞部分，也称为塑料粘附细胞，在骨髓中参与构成造血干细胞的生存和分化的微环境，且特定条件或微环境下可以分化为神经细胞［1］、心肌细胞［2］、和肌腱［3］等多种细胞。其特点有:(1)取材方便易于分离培养，避免了胚胎细胞的相关伦理问题;(2)具有强大的增殖和自我更新能力可跨胚层分化为多种细胞，使不可再生细胞的再生成为可能;(3)处于未分化的原始细胞状态，不存在主要组织相容性复合体(MHC)，避免了免疫排斥问题，还可自由通过血脑屏障到达脑内的各个部位［4，5］。为细胞移植的实验研究提供了极大的方便，具有广阔的研究前景和极大的临床实用价值。成为了目前医学领域研究最热门的焦点细胞之一。因此摸索一个简单、高纯度MSCs体外培养和扩增的方法极为重要。本实验通过贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，并利用流式细胞术检测其表面标志以确定其纯度。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

健康SD大鼠，雌雄不限，80～150 g(重庆第三军医科大学提供)。L-DMEM培养液、Hyclone胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)，二甲基亚枫(北京拜尔迪生物公司)，小鼠抗大鼠CD29-FITC、小鼠抗大鼠CD45-PE、小鼠抗大鼠CD90-PE(USBiological公司)，小鼠IgG-PE(BD Bioscierces公司)、IgG-FITC(Biolegend公司)，青霉素钠、硫酸链酶素(华北制药厂)。

1.2 主要仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司)，CO2孵箱(Thermo，美国)，高压消毒锅(TOMY，日本)，－20℃冰箱(青岛海尔)，－80℃冰箱(Forma Scientic，德国)，离心机DT5-1(北京时代北利离心机有限公司)，MILLI-Q超纯水纯化系统(Forma Scientic，德国)，光学倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 MSCs的分离、培养及筛选 取4 w左右健康清洁SD大鼠，脱臼处死后，置75%乙醇浸泡10 min，无菌情况下剪取双侧股骨及胫骨，于超净台内用PBS缓冲液冲洗数次，剪去骨周围组织及两端软骨，用20 ml注射器抽取L-DMEM单纯培养基反复冲洗骨髓腔，分离骨髓细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，去上清，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养基后接种于25 cm2塑料培养瓶中，至37℃、5%CO2孵箱中培养，24 h半换液、48 h全换液，逐渐去除未贴壁的悬浮细胞和死细胞，以后每2 d全换液1次，并观察细胞生长状况。培养至7～8 d后培养瓶内细胞融合至80% ～90%时进行传代，用PBS液缓慢冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶1～2 ml，倒置显微镜下观察细胞开始收缩、变圆，细胞间隙逐渐增大时弃去胰酶，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液终止消化，用吸管反复冲吹瓶壁，使细胞脱落，制成单细胞悬液。视细胞量按1∶2或1∶3传代，此时记为P1(第1代)，以后每3 d左右传代1次。

1.3.2 MSCs 的鉴定 通过流式术对大鼠MSCs表面标记物(CD29、CD45、CD90)进行检测:取细胞P1～10的细胞，弃去培养基，用 PBS洗涤2次，加入0.25%胰酶消化、离心(1000 r/min，5 min)收集细胞后，PBS重悬细胞，再次离心(1000 r/min，5 min)，弃上清，用 200 μl PBS液制成 5×105个MSCs的细胞悬液。分别将其分为3组，第1组加入大鼠IgG-FITC、IgG-PE各5 μl作对照，第2组加入大鼠 CD29-FITC、CD45-PE 各 5 μl，第 3 组加入CD90-PE 5 μl，混匀后室温避光 25 min，每管加入PBS液 2 ml，振荡器混匀后离心(1000 r/min，5 min)，弃上清，加入2%多聚甲醛200 μl固定，待上机检测。

2 结果

2.1 镜下观察MSCs

L-DMEM培养液中的全骨髓细胞接种至细胞培养瓶后，倒置显微镜下可见均一密集的椭圆形细胞，折光性强。24 h半换液后可见少量细胞贴壁生长，3 d全换液有部分细胞贴壁，倒去未贴壁的漂浮细胞后，可见有部分细胞由椭圆形变为多角形、短棒或短梭形等形态。4～6 d时，细胞折光性更强，并不断分裂增殖，细胞由短梭形、多角形变为长梭形，并逐渐扩散、相互交联，成集落样分布。7～8 d时，细胞均为长梭形。细胞传代后镜下可见形态呈一致的长梭状，且分布均匀。细胞的增殖速度较原代明显增快，3 d左右即可融合达80% ～90%(见图1)。

2.2 流式细胞术检测MSCs

流式细胞术检测大鼠MSCs表型，结果显示P3～6细胞CD29、CD90阳性率均大于90%，CD45阳性率均小于10%。细胞在P1～2时纯度逐渐升高。在P7～10时纯度逐渐降低(见图2)。

3 讨论

MSCs是来源于中胚层的除非造血干细胞以外的一类干细胞，20世纪70年代Friedenstein等首次从骨髓中分离出MSCs，虽然其在骨髓内含量较低，它取材方便，容易分离、获得及培养，具有高度增殖及自我更新能力，且免疫原性低，另外MSCs易于外源基因的转染和表达，不论质粒还是病毒均可携带目的基因转染 MSCs，而其功能不受影响［6，7］，可作为细胞移植治疗中枢神经系统疾病基因治疗的有效载体。随着研究的深入及技术的改进，目前获得MSCs的常见方法主要有以下几种［8，9］:密度梯度离心法(Percoll)、贴壁筛选法、免疫磁珠法和流式细胞仪分选法。这些方法中，密度梯度离心法由于反复离心，可能致使骨髓微环境中对MSCs生长有利的细胞因子和促贴附物质丢失，而不利于细胞的体外扩增;而流式细胞仪分选法和免疫磁珠法实验成本昂贵，骨髓需要量大，对细胞的活性影响较大，甚至导致完全失活，且难以获得大量高纯度的MSCs。因此，本实验采用贴壁筛选法，根据MSCs在塑料组织培养皿中贴壁生长，而白细胞和造血干细胞是悬浮生长对其进行逐步分离。MSCs在骨髓中密度很低，且随动物年龄增长而减少，故本实验选用幼年大鼠骨髓在L-DMEM培养基中培养，经历潜伏期、指数增生期和停滞期。原代细胞24 h即可贴壁，培养4～6 d呈对数生长，7 d达平台期。此方法获得的细胞生长良好且增殖快。

MSCs是一个异质细胞群，未发现特异性表型抗原;为了便于分析相关研究结果，国际细胞治疗学会统一了MSCs的鉴定标准，确定其表面抗原特征为［10］:CD73、CD90、CD105 CD29、CD106、CD146、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、神经生长因子受体(NGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、骨特异性碱性磷酸酶(STRO-3)等表达阳性，而CD45、CD34、CD79α或CD19以及 HLA 2DR阴性。本实验通过检测CD29、CD45和CD90来鉴定P1～10的MSCs，结果显示;P3～6大部分细胞表达CD29和CD90，极少量细胞表达CD45，提示所培养细胞为高纯度MSCs，适于做组织工程的种子细胞。

分离培养MSCs的方法中贴壁筛选法具有操作简单、便捷，对细胞活性影响小等优点，有利于MSCs的贴壁、增殖和筛选，且体外培养条件下生长性状稳定，筛选的MSCs纯度很高。

图1 A:原代细胞5 d;B:第4代MSCs(×100)

图2 流式细胞术检测第4代MSCs示:大部分细胞表达CD29和CD90，极少量细胞表达CD45

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