侵染甜椒的番茄褪绿病毒的分子鉴定

赵汝娜，王 蓉，师迎春，张桂娟，原 锴，范在丰，周 涛*

(1.中国农业大学植物病理学系，北京 100193；2.北京市植物保护站，北京 100029；3.北京市大兴区植保植检站，北京 102600；4.北京市房山区植物保护站，北京 102488)

侵染甜椒的番茄褪绿病毒的分子鉴定

赵汝娜1，王 蓉1，师迎春2，张桂娟3，原 锴4，范在丰1，周 涛1*

(1.中国农业大学植物病理学系，北京 100193；2.北京市植物保护站，北京 100029；3.北京市大兴区植保植检站，北京 102600；4.北京市房山区植物保护站，北京 102488)

番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是一种由粉虱传播的RNA病毒，可以侵染番茄和辣椒等常见蔬菜，已在世界多地造成严重危害。2012年在北京市大兴区调查蔬菜病毒病时发现保护地栽培的甜椒植株表现脉间褪绿症状，且植株上烟粉虱数量多，初步推测为ToCV危害。通过提取显症样品总RNA，利用ToCV特异性引物进行反转录PCR，扩增得到463 bp的目标条带。通过测序和核苷酸序列比对分析，表明该序列与国外已报道的ToCV HSP70h(the heat shock protein 70 homolog，热激蛋白70家族)基因序列相似性为99%。这是对ToCV在我国侵染甜椒的首次报道。

番茄褪绿病毒； 甜椒； RT-PCR

番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是危害世界许多地区多种作物的病毒，引起严重的褪绿和黄化病害，典型症状是植株下部叶片黄化，叶脉浓绿而脉间褪绿，与缺素症状非常类似[1]。该病毒最初在20世纪90年代发现于美国[1]，目前已经蔓延至世界多地[2-5]。ToCV为长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)成员，传播介体为粉虱，包括B型烟粉虱(Bemisiatabacibiotype B)、Q形烟粉虱(B.tabacibiotype Q)、A型烟粉虱(B.tabacibiotype A)、温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)和纹翅粉虱(T.abutilonea)，但不能通过汁液摩擦传播。常见的寄主包括茄科(番茄、甜椒、烟草等)、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等多种植物[6]。

2012年，笔者在对常见蔬菜病毒病害的调查中，在北京先后发现了表现ToCV侵染典型症状的番茄和甜椒植株，其中ToCV对番茄植株的侵染已经报道[7]。发病的甜椒植株叶片呈现脉间黄化，变脆易折，严重者叶片呈黄褐色，甚至出现坏死。该症状与ToCV引起的病害典型症状一致[1]。采回发病甜椒样品，提取总RNA经反转录PCR检测、序列测定和比对分析，鉴定为ToCV。这是该病毒侵染甜椒在我国发生的首次报道。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2012年10月在北京大兴区甜椒种植大棚中采集表现典型脉间褪绿症状且带有黄褐色病斑的甜椒叶片，整理后一部分直接用于提取总RNA，其余存于-20 ℃冰箱备用。

1.2 叶片总RNA的提取

利用TRIzol法提取甜椒叶片总RNA。取症状典型的叶片于液氮中研磨，将0.1 g粉末转入1.5 mL离心管中，迅速加入1 mL TRIzol试剂，振荡混匀，室温放置5 min后离心，将上清液转入1.5 mL离心管，加入 0.2 mL氯仿并混匀，室温放置5 min。再次离心后，将上清液转移至1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇并混匀。室温放置30 min。离心后，用75% 乙醇洗涤沉淀。最后用无核酶的去离子水溶解。

1.3 反转录PCR、序列克隆和测定

在无核酶的离心管中加入总RNA(2 μg)，0.5 μL 10 μmol/L Oligo (dT) primer，0.5 μL 10 μmol/L Random hexamers primer和1 μL dNTP Mix (10 mmol/L)，用无核酶的超纯水补充总体积至18.5 μL；65 ℃ 反应5 min，然后立即冰浴2 min。短暂离心后加入5 μL 5× first-strand buffer，0.5 μL RNAase Inhibitor和1 μL M-MLV反转录酶，充分混匀，37 ℃反应60 min。

将反转录得到的cDNA用Dovas等[8]报道的检测ToCV的特异性引物ToC-5(5′-GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGT-3′)和ToC-6(5′-AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC-3′)进行PCR，扩增ToCV编码的HSP70h基因部分序列。25 μL PCR反应体系如下：cDNA 2 μL，dNTPs (10 mmol/μL)0.65 μL，上游引物ToC-5和下游引物ToC-6各0.5 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，TaqDNA Polymerase 0.25 μL(5U/μL)，ddH2O 18.6 μL。PCR反应条件为：94 ℃变性3 min，按下列条件进行35个循环：94 ℃变性30 s，56 ℃复性45 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。全部PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切取约500 bp的目标条带，用凝胶回收试剂盒回收纯化后，克隆到pMD18-T载体(TaKaRa，大连)。转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆经验证后，由华大基因公司进行测序获得序列。

1.4 序列比对分析

利用NCBI序列比对工具BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序nucleotide blast比对分析克隆获得的序列，根据相似性确定病毒种类。

2 结果与分析

2.1 样品检测

以反转录得到的cDNA为模板，利用ToCV的特异性引物ToC-5和ToC-6进行PCR检测，从表现典型症状的甜椒样品中扩增得到约450 bp的条带，与感染ToCV的番茄阳性对照样品[7]的扩增结果一致(图1)。结果表明采集的甜椒样品可能被ToCV侵染危害。

图1 利用RT-PCR在甜椒样品中检测ToCVFig.1 Detection of ToCV on sweet pepper samples using RT-PCR

2.2 ToCV北京分离物部分序列分析

将PCR扩增获得的约450 bp的片段纯化，克隆到pMD18-T载体并进行序列测定。经BLAST程序nucleotide blast进行序列相似性检索和分析的结果表明：检测为阳性的来自北京郊区的甜椒样品cDNA扩增得到的候选病毒基因组部分序列，与ToCV序列相似性最高，均为99%，表明在北京郊区甜椒生产大棚中采集的甜椒样品确系被ToCV感染。

3 讨论

虽然国外已经有较多研究和报道[1-6]，在我国ToCV是最近被发现的一种新病毒，其在我国的发生和危害情况需要开展详细的调查和研究。ToCV引起的叶片褪绿黄化症状类似于植株缺素症状，导致在病害调查中不易对其发生进行正确判断。虽然ToCV引起的褪绿黄化病不导致绝产，但其引起的损失多在30%～40%，减产明显[9]。因ToCV的传播介体烟粉虱食性杂，在多种作物及杂草上极为常见[10]，尤其在保护地栽培条件下可以周年发生，所以导致这类褪绿黄化病毒病大面积发生和蔓延的可能性非常高。

由烟粉虱传播的病毒病已给我国番茄等茄科作物生产造成严重损失，其中最为典型的病害是由番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)等一些双生病毒引起的番茄黄化曲叶病毒病，但TYLCV侵染甜椒一般不引起明显的症状，对甜椒产量的影响也不明显[11]，所以目前在甜椒生产中一般不注意防治烟粉虱。随着ToCV的发生，其对甜椒生产的危害将逐渐增加，如不加以重点防范，必将在生产上造成严重损失。由于国内外目前没有对ToCV的抗病品种，生产中应注意采取综合措施防治烟粉虱和该病毒的发生和传播。防治策略和方法可以参照许多文献中介绍的番茄黄化曲叶病毒病的综合防治方法，主要措施是培育无毒幼苗，防治烟粉虱和清除其他寄主。

[1] Wisler G C, Li R H, Liu H Y, et al.Tomatochlorosisvirus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato[J].Phytopathology, 1998, 88(5): 402-409.

[2] Lozano G, Moriones E, Navas-Castillo J.Complete nucleotide sequence of the RNA2 of the crinivirus tomato chlorosis virus[J].Archives of Virology, 2006, 151(3): 581-587.

[3] Lozano G, Moriones E, Navas-Castillo J.Complete sequence of the RNA1 of a European isolate ofTomatochlorosisvirus[J].Archives of Virology, 2007, 152(4): 839-841.

[4] Kataya A, Stavridou E, Farhan K, et al.Nucleotide sequence analysis and detection of a Greek isolate ofTomatochlorosisvirus[J].Plant Pathology, 2008, 57(5): 819-824.

[5] Wintermantel W M, Wisler G C, Anchieta A G, et al.The complete nucleotide sequence and genome organization ofTomatochlorosisvirus[J].Archives of Virology, 2005, 150(11): 2287-2298.

[6] Wintermantel W M, Wisler G C.Vector specificity, host range, and genetic diversity ofTomatochlorosisvirus[J].Plant Disease, 2006, 90(6): 814-819.

[7] Zhao R, Wang R, Wang N, et al.First report ofTomatochlorosisvirusin China[J].Plant Disease, 2013(doi.org/10.1094/PDIS-12-12-1163-PDN).

[8] Dovas C I, Katis N I, Avgelis A D.Multiplex detection of criniviruses associated with epidemics of a yellowing disease of tomato in Greece[J].Plant Disease, 2002, 86: 1345-1349.

[9] Hanafi A.Invasive species: a real challenge to IPM in the Mediterranean region? [R].European Whitefly Studies Network Newsletter no.13.John Innes Center, Norwich (GB),2002:4.

[10]De Barro P J, Liu S, Boykin L M, et al.Bemisiatabaci: a statement of species status[J].Annual Review of Entomology, 2011, 56: 1-19.

[11]Morilla G, Janssen D, García-Andrés S, et al.Pepper (Capsicumannuum) is a dead-end host forTomatoyellowleafcurlvirus[J].Phytopathology, 2005, 95(9): 1089-1097.

MolecularidentificationofTomatochlorosisvirusonsweetpepper

Zhao Runa1,Wang Rong1,Shi Yingchun2,Zhang Guijuan3,Yuan Kai4,Fan Zaifeng1,Zhou Tao1

(1.DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 2.BeijingStationofPlantProtection,Beijing100029,China; 3.DaxingStationofPlantProtectionandQuarantine,Beijing102600,China;4.FangshanStationofPlantProtection,Beijing102488,China)

Tomatochlorosisvirus(ToCV), a RNA virus transmitted by whiteflies, induces severe damage to tomato and pepper production in the world.In a survey of virus disease on vegetables in 2012, a yellowing disease was found on greenhouse grown pepper plants in Daxing district, Beijing.Meanwhile, a large number of whiteflies (Bemisiatabaci)were found on pepper plants.We suspected the diseased pepper plants were infected by ToCV.A Reverse Transcript-PCR assay was performed with total RNA isolated from diseased samples using specific primers for ToCV.Amplified DNA fragments (463 bp) were obtained.The nucleotide sequences of the fragments had the highest identity (99%) with that of ToCV.To our knowledge, this is the first report of ToCV on pepper in China.

Tomatochlorosisvirus; sweet pepper; RT-PCR

2013-04-02

： 2013-04-28

公益性行业(农业)科研专项(201303028)；长江学者和创新团队发展计划(IRT1042)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.024

* 通信作者 E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn