不同水平纳米ZnO 对幼兔肠黏膜及其黏膜免疫相关细胞影响的研究

王栋梁，庞全海

(1.山西朔州职业技术学院，036002；2.山西农业大学动物科技学院，030801)

锌(Zn)是人和动物主要的微量元素之一，参与许多辅酶的构成，在智力发育、生长和维持机体免疫功能方面具有重要作用，参与体内各类物质的代谢。目前，锌的营养研究多限于鼠、禽和猪，而纳米ZnO 的研究也只是在仔猪上的初步探讨，以家兔为研究对象报道较少。本研究目的是探索日粮中添加不同水平的纳米ZnO 对幼兔生长性能和肠道免疫的影响，以期为幼兔纳米ZnO 需求量的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样本

本研究以40 日龄幼兔为研究对象，采用单因子试验设计(表1)，选择日龄，体重基本一致的幼兔36 只，随机分为4 个处理组，每个处理3 个重复，每个重复3 只幼兔。试验期进行42天。采用spss11.5 软件对数据进行方差分析和组间LSD 多重比较。纳米ZnO：30nm，由山西丰海纳米有限公司提供。

表1 试验设计方案

1.2 饲粮配制

表2 基础日粮配方和营养水平

2 测定指标

2.1 生长性能指标

2.1.1 平均日增重(ADG)：幼兔于试验第0、第42 天早晨8∶00空腹单个称重。计算日增重(ADG)。

ADG =(试验末平均体重－试验初平均体重)/试验天数。

2.1.2 平均日采食量(ADFI)：以重复为单位每天结算采食量。

ADFI＝(配料总数－所剩饲料量)/试验天数×每组试验兔数。

2.1.3 料肉比(F/G)：根据日增重和日采食量计算F/G。F/G＝日采食量/日增重

2.2 组织学检查

2.2.1 取材

试验期完毕后，剖杀幼兔，分别取3-5cm 十二指肠、空肠和回肠，用生理盐水涮清洗内容物，每段分为3 份，依次浸入Bouins 氏固定液、4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol/L，PH7.4)、Carnoy 液(作石蜡切片)中。

2.2.2 光学显微镜观察

①石蜡切片的制作。

②常规HE 染色，显示小肠黏膜结构、上皮内淋巴细胞。

③PAS 染色法，显示小肠上皮表面的糖蛋白(细胞衣)、杯状细胞。

④观察与测量 应用OLMPLUS 病理图像系统和照相软件，测量小肠的肠壁厚度、黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度。分别取5 张切片，选取10 根最长肠绒毛的长度、最深隐窝深度和最厚黏膜厚度以及最厚肠壁厚度，应用spss 软件对数据进行方差分析和组间LSD 多重比较。结果以均数±标准差(±S)表示。

3 结果

3.1 幼兔生长性能的结果

在整个试验期幼兔无死亡，生产性能指标见表3。

3.1.1 试验二组日增重高于其它三个组，其与对照组相比差异显著(P＜0.05)，日增重提高12%；与试验一组和试验三组相比没有明显差异(P＞0.05)，日增重提高6%和5%。

3.1.2 添加纳米ZnO 可以提高幼兔的日采食量，但是各组之间差异不显著。

3.1.3 添加纳米ZnO 后，试验二组的料肉比与对照组、试验三组差异显著，饲料效率分别改善5%和4%(P＜0.05)，其它组差异均不显著(P＞0.05)。

3.1.4 添加不同水平纳米ZnO 后，试验二组的的最终体重与对照组差异显著(P＜0.05)，其它组差异均不显著(P＞0.05)。

表3 不同水平纳米ZnO 对幼兔生产性能的影响

3.2 肠黏膜的上皮形态学变化

3.2.1 肠黏膜上皮的光学显微镜镜观察光镜观察显示，小肠横断面上具有3～5 个皱襞，每个皱襞上分布10～20 根肠绒毛。试验组幼兔的小肠结构较完整，层次清晰，肠黏膜表面的纹状缘结构分明，肠绒毛排列整齐致密。肠黏膜上皮细胞排列紧密，染色分明。柱状细胞胞浆丰富，胞核呈椭圆形，位于细胞基部。杯状细胞为高脚杯状，呈粉红色，分布于柱状细胞之间。各试验组十二指肠和空肠黏膜主要不同点在于25mg/kg 的纳米ZnO 组的肠绒毛最为粗壮，细胞衣更厚，试验一组和试验三组次之，对照组的肠绒毛最细，且肠绒毛排列不整齐，多处肠绒毛顶端有脱落现象，细胞衣较薄。

3.2.2 小肠肠壁厚度、黏膜厚度、绒毛长度、和绒毛长度/腺窝深比值

表4 各组幼兔十二指肠和回肠壁厚度、黏膜厚度、绒毛长度、和绒毛长度/腺窝深比值(X±S)

饲料添加不同水平的纳米ZnO 对幼兔小肠的肠壁厚度、黏膜厚度、绒毛长度及绒毛长度/腺窝深比值的影响分别见表4和图1。各试验组的小肠绒毛排列整齐、致密，其中以试验二组的最为显著。例如，试验二组的十二指肠、空肠、回肠的绒毛长度分别为739.6±40.7μm、488.1±68.6μm，十二指肠的肠绒毛比空肠的长，如表1-3 和图1-1 所见，纳米ZnO 对幼兔肠壁厚度、黏膜厚度、绒毛长度略高于对照组，差异不显著，但试验二组的绒毛长度/腺窝深比值(V/C)明显高于对照组，十二指肠和空肠各约增加了41%、50%。

图1 不同水平的纳米ZnO 对幼兔十二指肠和空肠结构的影响

3.3 黏膜相关免疫细胞

3.3.1 小肠上皮内淋巴细胞

HE 染色结果可知，上皮内淋巴细胞为一群特殊淋巴细胞，散在分布于肠绒毛上皮细胞之间，大部分位于小肠上皮细胞基侧膜附近，少量分布于上皮核层和顶层，固有层内也有淋巴细胞分布。以小型细胞为主，胞核大且圆，色染较深，胞浆少。

不同试验组同一肠段的小肠的上皮内淋巴细胞数量的分布有差异显著(表5 和图2)。试验二组的的十二指肠上皮淋巴细胞最多，每100 个柱状细胞之间含有上皮内淋巴细胞40.8±5.9 个，与对照组的上皮内淋巴细胞比较差异显著(P＜0.05)；试验一组和试验三组每100 个柱状细胞之间上皮内淋巴细胞分别有37.2±4.0、34.6±3.8 个，对照组的最少，有32.4±3.0个。回肠和空肠的结果类似于十二指肠，试验二组的上皮内淋巴细胞数量增加明显，与对照组差异显著(P＜0.05)；其余各组之间差异不显著(P＞0.05)。

表5 各组幼兔小肠黏膜IEL 的数量(IEL 个/100 柱状细胞)

图2 不同水平纳米ZnO 对幼兔小肠黏膜上皮内淋巴细胞数量的影响

3.3.2 肠黏膜杯状细胞

杯状细胞分布于柱状细胞间，多集中分布于肠腺，排列紧密。PAS 染色，杯状细胞为高脚杯状，呈紫红色。

表6 各组小肠黏膜杯状细胞数量(个/100 柱状细胞)

由表6 可知，从十二指肠到回肠，杯状细胞逐渐增加，约增加36%～65%。同一肠段，试验二组的杯状细胞数量最多。试验一组和试验三组的杯状细胞略高于对照组。比如，试验二组幼兔肠黏膜每100 个柱状细胞含杯状细胞数为6.6±1.5 (十二指肠)、7.2±1.9 (空肠)。明显高于对照组，3.4±1.1 (十二指肠)、4.2±1.3(空肠)。试验一组又略高于试验三组。

图3 不同水平纳米ZnO 对幼兔小肠黏膜杯状细胞数量的影响

4 分析与讨论

结果表明：给40 日龄的幼兔饲喂纳米ZnO 后，能改善料肉比、提高日增重，尤其是添加25mg/kg 的纳米ZnO 组，其幼兔的日增重和料肉比明显好于对照组，饲料改善率达5%，差异显著(P＜0.05)。由本实验可知，实验二组幼兔的小肠黏膜上皮完整，肠绒毛健壮。这表明25mg/kg 纳米ZnO 饲料可以促进幼兔的小肠吸收，保持小肠黏膜上皮细胞结构的完整，且好于10mg/kg 和50mg/kg 的纳米ZnO。25mg/kg 的纳米ZnO 组幼兔的绒毛长度明显高于对照组，而50mg/kg 纳米ZnO 组兔的绒毛长度有缩短的趋势(图1-1)，这也与前面生长性能指标的结果相一致，上述结果表明25mg/kg 纳米ZnO 可以增加小肠肠绒毛的表面积，促进的消化吸收，改善黏膜结构。

本试验结果发现，饲料中添加25mg/kg 的纳米ZnO 后，增加了幼兔小肠上皮内淋巴细胞和肠黏膜杯状细胞的数量，与对照组相比，在十二指肠试验二组的上皮内淋巴细胞数增加了26%；在回肠，杯状细胞数增加了61%。上皮内淋巴细胞是黏膜免疫系统中首先接触抗原的免疫活性细胞，是特殊的淋巴细胞群。其参与免疫反应，通过伪足接触上皮细胞，加快上皮细胞的再生，是重要的肠黏膜免疫屏障作用。杯状细胞分泌粘液，可以保护肠黏膜，是构成肠道机械屏障的结构之一。其中25mg/kg的纳米ZnO 效果更为明显。

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