针灸“补肾益髓”法对阿尔茨海默病模型大鼠海马区脑啡肽酶的作用

罗琴琴，杜艳军

(湖北中医药大学针灸骨伤学院，武汉 430061)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseases，AD)，即老年性痴呆，是一种进行性的神经退行性疾病，多以近事记忆丧失为首发症状，逐渐出现记忆减退、认知功能损害、精神行为异常等症状，病情呈进行性加重。《2013年世界阿尔茨海默病报告》指出：2010—2050年，全球范围内60岁及以上的老年人群中,13%(约2.77亿)的人需要长期护理，而这2.77亿人中约有一半的人患有阿尔茨海默病。据报道，我国随着老年化人口的快速增涨，阿尔茨海默病的患病人数也会越来越多，其发病率与国际水平相当。面对这一严峻的局势，虽然国内外医学研究者对其治疗方法有了深入的探索，但仍未寻求到一种可以治愈或者阻止其病情发展的治疗方法。目前的研究表明：β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在脑内沉淀形成老年斑是AD主要的病理改变之一，而且Aβ及其兴奋性神经毒是导致神经元损伤和死亡,患者出现记忆衰退的关键[1]。因此,减少Aβ的生成和促进其降解，是改善AD病理变化，减少Aβ的神经毒的根本途径。近年研究[2]表明,脑啡肽酶(NEP)是体内重要的Aβ降解酶，它通过催化降解Aβ而调节脑内Aβ的水平。先前有关AD的实验研究[3]显示,针刺提高了AD大鼠的认知能力，从症状上肯定了针灸对AD的疗效。本研究根据补肾益髓的治则，采用传统针灸疗法治疗AD模型大鼠，观察该疗法对大鼠海马区NEP表达的影响,以期为针灸治疗AD的临床应用提供一定的理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组 由湖北省疾控中心供的SPF级Wistar大鼠，雄性58只,月龄为12个月左右，体质量为(360±20)g。实验前适应性驯养 1周后，所有大鼠经Morris水迷宫测试，剔除不合格者(即反应过于迟钝或灵敏者)。将合格的40只大鼠随机分为4组:正常组、模型组、假手术组和治疗组。正常组:常规饮水和饲料, 不给予任何处理；模型组:造模后不给予任何处理；假手术组：颅内注射等量生理盐水，手术方法及注药方法同模型组；治疗组：造模后,采用针刺和艾灸方法治疗。整个实验过程中,全部实验动物均用在非铝制品的器皿中存放相同的饲料喂养,自由饮食, 光线适中。治疗结束后, 各组大鼠在同一天内取材。

1.2 主要实验试剂和仪器 主要仪器：WDT-Ⅱ型微电极推进器脑立体定位仪(西安西北光电仪器厂)，AS325轮转式石蜡切片机(Shandon),IB-PS包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，TI-SR倒置荧光显微镜(日本尼康)，DS-U3成像系统(日本尼康)，WD-9405A脱色摇床(北京市六一仪器厂),BHS-313型Olympus显微镜(Olympus,Japan),Image-pro-plus图像分析系统(Media Cybernetics Inc,USA)。主要试剂：Aβ1-42(美国Sigma公司)，BSA(A7030,美国Sigma公司)，CY3标记山羊抗兔NEP多克隆抗体(美国jackson公司)，兔抗大鼠NEP多克隆抗体(美国Sigma公司)。

2 实验动物

2.1 动物模型制作 大鼠称重，用10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，行俯卧位固定于颅脑立体定位仪上,保持前后囟在同一水平，剪开头皮，暴露前囟，在前囟后3.3 mm，中线左右各旁开1.5 mm，用牙科钻钻一小孔(直径1 mm),垂直插入微量注射器，使针尖自颅骨表面缓慢进针3.3 mm至海马区，用微量注射器分别注入5 μL聚集肽的Aβ1-42(Aβ1-42先在50 μL二甲基亚砜溶液中混匀溶解，离心机离心后再放入50 μLPBS缓冲液中稀释，离心机离心后4 ℃冰箱保存备用)，5 min内注射完，注射后留针5 min，按1.0 mm/min速度缓慢出针，以免拔针时药物溢出，术后牙托粉封固颅骨孔，缝合头皮，局部外敷青霉素G粉，术后3 d内每天肌注青霉素80万U以预防感染。

2.2 动物治疗方法 治疗组大鼠造模后，于“百会”和双侧“肾俞”[4]3个穴先进行针刺(1寸毫针)，留针15 min后，再用细艾条(自制直径约0.6 cm)在穴位上方2～3 cm处行温和灸，使穴位表皮温度在(43±1)℃，持续15 min，1次/d，6 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共2个疗程。

2.3 动物取材 治疗结束后，将各组大鼠经10%水合氯醛(3 mL/kg，腹腔注射)中度麻醉后，仰卧固定于鼠板上，自领下至上腹行胸腹联合切口，切断肋骨、膈肌，暴露出心脏，向左心室插入灌注针头，快速灌入无菌生理盐水500 mL冲洗组织内血液，同时剪开右心耳，冲洗至肝脏变白，灌注时间约10 min，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意，完毕后，断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱分离海马，置于4%中性缓冲甲醛中，浸泡外固定24 h，取海马标本。NEP的阳性表达采用SABC免疫组化和免疫荧光法检测(具体按试剂说明书操作)。

3 实验结果

2种检验方法中，各组分别随机选10张切片，免疫组化切片在100倍光学显微镜下拍摄；免疫荧光切片在200倍的荧光显微镜下拍照,拍照时尽量让组织充满整个视野。所有照片应用Image-Pro Plus6.0软件进行分析，得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD值),IOD值越大，表示NEP阳性表达越强。各组的IOD值统计见表1。

结果表1所示，海马CA1区NEP表达成像的积分密度值可以间接反应NEP 表达量的水平，其值越高表示NEP的含量越多，反之亦然。经统计分析，笔者发现,假手术组与正常组比较P>0.05，即2者间无统计学意义，2组间结果没有明显的差别，表明在AD模型的制作过程中，手术给实验造成影响可以忽略。模型组与假手术组相比较，2种检测结果分别是P<0.05和P<0.01，具有统计学意义，提示造模成功，且模型的成功主要是由于注射了凝聚态的Aβ1-42。模型组与治疗组相比较，2个实验结果均为P<0.01，有统计学意义，表明经针灸治疗后，大鼠海马NEP显著性增高，从而促进Aβ的降解，改善了AD的病理变化，延缓了其病理进程。根据上表中免疫组化的结果绘制了柱形图，如图1所示,更直观的显示了免疫组化中各组NEP的表达情况。

表1 2种实验中NEP阳性表达的累积光密度值

注：与正常组相比较，#P>0.05；与假手术组相比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组相比较，▲P<0.01，▲▲P<0.01。

注：与正常组相比较，#P>0.05；与假手术组和正常组相比较，△P<0.05；与模型组相比较，△△P<0.091。图1 各组大鼠海马区NEP表达成像的积分密度值比较

各组免疫荧光切片在激发波长为510～560 nm拍下目的蛋白NEP的表达(红光)。若图中红色光斑越亮越密集，表明NEP的表达越多。经比较4组图片中红光的亮度和密度可以看出正常组和假手术组的NEP表达最多，且正常组较假手术组表达更显著,可能存在造模中的手术创伤的影响，但模型组与假手术组相比，NEP的表达明显减少，其手术创伤可以乎略,表明此次造模成功；经治疗后，NEP的表达较模型组增强，说明该疗法可以促进NEP的表达。

4 讨论

4.1 补肾益髓法 阿尔茨海默病在祖国医学中可归属为心神失常、善忘、呆病、痴证等，病位在脑。虽然其病因复杂，但主要是因肾虚精亏，脑减髓消，神机失用而致，可见该病与肾和脑密切相关。中医认为肾主骨，生髓充脑，且《灵枢经·海论》称：“髓海有余，则轻劲多力，自过其度；髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”现代科学方法也表明了肾与脑关系密切,李航等[5]指出交感神经-肾上腺素能系统与肾阴阳的虚实有着明显关系，沈自尹[6]发现肾虚证存在着下丘脑-垂体-靶腺(甲状腺、肾上腺、性腺等)多轴的功能紊乱。由此可见，补益肾脏，益髓充脑是治疗AD的关键,并且此治疗原则在先前的多个相关实验研究中[7-9]得到了肯定疗效。因此，笔者选用位于脑之颠的“百会”和肾的背腧穴“肾俞”治疗AD大鼠，以达到补肾益髓的作用。

4.2 NEP与阿尔茨海默病 大脑皮质和海马神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SP)是AD显著的神经组织学病理特征之一。目前，许多研究者认为Aβ的沉积是AD病理的始发因素和中心环节。因此，减少Aβ的产生、促进其降AD的防治有重要的意义。在生理条件下,Aβ在机体中的产生和清除处在一个动态平衡的状态中，机体不会受到损伤性影响。但当这一动态平衡被打破,即Aβ的产生增多或者清除减少，则可导致Aβ的异常增多，聚集，最终在细胞外形成沉积的老年斑,引起一系列的炎症反应，在细胞内则产生神经毒作用，均能对神经元造成损伤。目前，体内实验已证明了脑啡肽酶可以裂解细胞外的Aβ，减少其对神经元的损伤。

脑啡肽酶(NEP)是一种含有锌离子的Ⅱ型膜蛋白，为中性内肽酶M13家族中的一员。作为胞外酶，NEP优先水解细胞外的寡肽(<5 kDa)，水解作用发生在疏水氨基酸残基的氨基侧，因此NEP尤其这一特适合分子量较小的，且含有40～42个疏水氨基酸的Aβ肽的降解[10]，同时NEP也可以列解内啡肽、生长抑素、缓激肽等一些分子量小于5 kDa的神经肽。在脑内，表达于NEP主要表达于黑质纹状体通路及海马等处神经元的突触前膜和突触后膜,而这些部位正是易于形成老年斑的区域，且临床研究也发现，AD患者脑内易于形成老年斑的海马和颞中回等区域NEP含量显著下降[11]。大量实验表明[12-13]，Aβ在脑内的水平随NEP的增多而减少，当NEP的基因敲除或使用NEP抑制剂时，Aβ的含量增多。由此可见，NEP对Aβ的降解中起着重要的作用，目前已广泛认为NEP为Aβ降解的限速酶。

目前研究发现，多种途径如自噬溶酶体、泛素蛋白酶体系统等和各种生物活性分子如脑啡肽酶、前序列蛋白酶、内皮素转化酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转换酶、纤溶酶和基质金属蛋白酶-9等，共同构成了Aβ的降解系统。本研究表明经“补肾益髓”的针灸疗法治疗后，AD大鼠海马区NEP的表达显著增加，说明该治疗可通过提高NEP的含量，促进 Aβ降解，减少其对神经元的毒性损伤，延缓AD的病理进程。而NEP作为Aβ降解系统中的一员，由此可以推论该针灸疗法可能具有上调Aβ降解系统功能的作用，从而全面促进Aβ的降解，因而缓解AD的病理进程。

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