哈蟆油基原物种DNA分子鉴定研究

高晓晨，刘 冬，白俊武，于江波，赵娜娜，宗 颖，崔丽娜，张 辉*，孙佳明*

(1.长春中医药大学，长春 130117;2.吉林敖东延边药业股份有限公司，吉林 敦化 133700)

哈蟆油(Ranaeoviductus)为我国常用中药材，具有补肾益精，养阴润肺的作用。据《中国药典》2010年版1部记载其来源为蛙科动物中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得[1]。中国林蛙是中国东北长白山特有的珍稀野生动物。分布于辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、甘肃、河北、山东、山西、陕西、河南、青海、四川等地[2]。黑龙江林蛙，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁等省[2]。目前，哈蟆油基原物种的鉴定方法主要为依据理化性状、显微特征等传统鉴别方法[3]。但这些方法主要以形态学为基础，不仅受到遗传因素的影响，而且与中国林蛙的生长环境、生长发育阶段有密切的关系。在鉴别过程中稳定性较差，影响鉴定结果[4]。可见，传统的形态学及理化性质鉴定难度大，现需要一种准确有效的方法来鉴定。 DNA条形码(DNA Barcoding)是利用基因组中一段公认标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术[5]，由加拿大动物学家Hebert等[6]首次提出。近年来该技术在物种鉴定方面有广泛的应用和迅速的发展，并且DNA条形码技术简便高效,不受样品的形态性状以及研究者的专业水平限制，可有效的鉴定中药材[7]。本研究对哈蟆油基原物种进行COI序列研究，分析其药材的物种变异,建立哈蟆油基原物种DNA分子鉴定方法,为其鉴定提供有效的手段。

1 材料与方法

1.1 材料 共收集样本12份，经长春中医药大学张辉教授鉴定为中国林蛙和黑龙江林蛙。其中中国林蛙7份，采自吉林汪清(标本号SJM-RTC-1102)、黑龙江牡丹江(标本号SJM-RTC-1103)、辽宁新宾(标本号SJM-RTC-1105)、内蒙古通辽(标本号SJM-RTC-1106)、山东青岛胶南区(标本号SJM-RTC-1107)、山东青岛崂山区(标本号SJM-RTC-1108)。黑龙江林蛙5份，采自吉林集安(标本号SJM-RA-1101)、黑龙江五常(标本号SJM-RA-1104)、辽宁新宾(标本号SJM-RA-1105)、内蒙古通辽(标本号SJM-RA-1106)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用灭菌后的手术剪把样品(哈蟆油或肌肉组织)剪成小块,取30 mg样品，用液氮研碎后，使用动物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.)提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增及电泳 扩增引物为COI序列通用引物:正向为LCO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGA-

TATTGG-3’，反向为HCO2198 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’[8]。PCR反应体积为20 μL，体系内含Taq Master Mix 10 μL，引物对各1.0 μL(2.5 mol/L)、双蒸水7 μL、DNA提取液1 μL(约30 ng)[9]。扩增程序为94 ℃，1 min；94 ℃，1 min，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5 cycles；94 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35 cycles；72 ℃，5 min[10]。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，上4 μL的PCR产物，条件为135 V电压20 min。DL2000 Marker从上至下为2 000、1 000、750、500、250和100 bp(Takara公司)。结果，实验样品在500～750 bp间出现亮带，条带清晰，DNA扩增成功，进行测序。

1.2.3 数据处理 PCR扩增产物使用ABI 3730XL测序仪(华大基因公司)双向测序。测序后得到正反两向峰图,利用Codon Code Aligner V4.2.7(Codon Code Co.)校对拼接,去除引物区，获得长度为658 bp的样品序列。对于从Genbank获得的COI序列，采用Codon Code Aligner V4.2.7软件，与拼接好的样品序列比对后，去除与样品序列相对应的658 bp以外的区段，最后保留长度≥550 bp的网上序列。将所有序列用MEGA(Molecular evolutionary genetics analysis)6.0软件比对并进行遗传距离等分析。

2 结果与分析

2.1 哈蟆油基原物种DNA提取与PCR扩增 用COI序列对哈蟆油基原物种样品进行分析,实验样本均可以进行PCR扩增并成功测序，琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增电泳图，扩增效果良好，条带较亮，无拖尾现象。

2.2 哈蟆油基原物种的种内变异

2.2.1 中国林蛙 中国林蛙12条序列比对后序列长度为662 bp,GC含量为47.7%～49.9%，平均GC含量49.0%。种内平均K2P距离为0.042，种内最大K2P距离为0.058。有34个碱基变异位点，其中346位点既有A-G变异又有A-T、T-G变异，见表1。

表1 中国林蛙种内碱基变异情况表

2.2.2 黑龙江林蛙 黑龙江林蛙8条序列比对后序列长度为658 bp，GC含量为45.2%～46.1%，平均GC含量45.8%。

有2个碱基变异位点分别为169位点的C-A变异和499位点的C-T变异。种内平均K2P距离为0.003，种内最大K2P距离为0.005。

2.3 物种鉴定结果 PCR产物经测序后得到正反向峰图,采用CodonCode Aligner V2.06校对拼接获得长度为658 bp的样品序列，原始图谱为清晰的单峰图谱，干扰信息低于正常信号的10%。样品序列经BLAST比对，为基原物种。

3 讨论

目前，DNA条形码已成为物种鉴定和分类研究的热点[7,11]。COI序列通用性高[12]，操作不当，可能会将异源污染的COI序列扩增出来，因此在DNA提取样时要进行表面清洁，以避免异源污染对样品鉴定的影响。在DNA提取过程中发现,若完全按照试剂盒操作说明进行操作，得到的DNA含量低。笔者结合本实验情况对操作流程进行如下改良:1)适当延长水浴时间，有利于样品细胞消化，重复实验表明56 ℃水浴2 h效果最好。2)动物肌肉组织蛋白质含量较多,影响样品DNA的提取效果，故加入氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次，每次10 min，除去溶液中的蛋白质。

本实验运用改良后的试剂盒，对哈蟆油基原物种进行DNA提取,COI序列引物及PCR扩增，获得哈蟆油基原物种序列。由结果可知:所建立的哈蟆油基原物种DNA分子鉴定方法可靠、稳定，为其鉴定提供有效的手段。

[1]国家药典委员会.中国药典：1部[M].北京:化学工业出版社,2010:147.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999:421.

[3]刘娟,刘爽,刘程诚.哈蟆油的真伪鉴别[J].黑龙江医药科学,2009,32(2):20-21.

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[5]陈士林,宋经元,姚辉,等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物,2009,7(5):322-327.

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[7]陈士林,姚 辉,宋经元,等.基于DNA barcoding(条形码)技术的中药材鉴定[J].世界科学技术——中医药现代化,2007,9(3):7-12.

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[9]罗盤,陈士林,陈科力,等.基于芸香科的植物通用DNA条形码研究[J].中国科学(生命科学),2010,40(4):342-351.

[10]Hebert P D N,Cywinska A,Ball S L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,2003(270):313-321.

[11]陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志,2013,38(2):141-148.

[12]陈士林,庞晓慧,姚辉,等.中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J].世界科学技术——中医药现代化,2011,13(5):747-754.