针刀、电针和圆利针对实验性膝骨关节炎兔关节软骨病理和超微结构的影响

黄怡然,李文迅,张 茜,李 娜,余 飞,金英利,雷林丹,李玉波,郭长青

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京100029)

骨关节炎(OA)是临床常见致残率较高的关节疾病，其特点是关节周围软组织损伤，从而导致关节软骨损伤的发生，最终累及整个关节，形成关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害。膝骨关节炎(KOA)以膝关节疼痛、僵硬和肌肉运动功能障碍为主要临床表现。研究结果认为,KOA是由于一系列作用而导致的关节异常性塑形重建产生的[1]，软骨体内平衡的维持与骨相似,当发生KOA时关节软骨基质的丧失包括关节软骨减压区域的软骨钙化和增压区的软骨细胞坏死[2]。相关研究还认为，关节软骨的纤维化和剥脱大于其塑形重建，仅在关节面不同部位的基底钙化软骨上才有纤维化和塑形重建同时存在。塑形重建主要发生在非负重区，而纤维化则在负重区特别明显[3]。这一过程较为复杂，但已经明确的是,关节软骨的塑形重建是形成进行性KOA病理过程的重要原因。中医骨伤科文献提出“骨正筋柔”“筋骨并重”等概念，针刀、圆利针等松解法以“调筋治骨”为基本原则，通过对膝关节周围软组织的松解，降低软骨基质退变及骨质硬化、增生等现象，即通过“调筋”改善和恢复了关节的“筋”“骨”平衡，达到了“治骨”的效果。因此，与电针对照，开展针刀、圆利针松解法对膝骨关节炎模型兔软骨形态学的影响具有重要的现实意义。

1 实验材料

1.1 材料 健康新西兰大白兔45只，体质量2.0～2.5 kg，由北京金牧阳实验实验动物养殖有限责任公司提供，动物生产许可证号：SYXK(京)2013-0022。实验过程中对动物的处置严格遵守国家科技部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物自由饮水和摄食，光照与黑暗为12 h交替，室温为20～22 ℃。按随机原则将动物分为5组，正常对照组、模型组、针刀组、电针组、圆利针组，每组9只，其中每组1只用于造模成功的病理检测，其余8只用于其他指标检测。

1.2 主要试剂及仪器设备 试剂：4%多聚甲醛、100%乙醇、碘伏、苏木素伊红染色试剂、EDTA-2Na、石蜡、磷酸缓冲液、二甲苯等试剂均采购自北京百诺威生物科技有限公司；2.5%戊二醛、丙酮、醋酸铀、枸橼酸铅、饿酸(美国SPI)、环氧树脂618(E51)包埋剂、150目带膜铜网等均购自北京中科科仪技术发展有限责任公司。仪器:石蜡切片机(Leitz 1410型，德国)，BMJ-Ⅲ型包埋机及冷冻台(中国)，H8-202型尼康显微镜(日本Nikon)，奥林巴斯全自动显微摄影系统(日本)，超薄切片机(瑞典LKB)，Quanta 250扫描电子显微镜(捷克FEI，北京中医药大学电镜室)。

2 实验方法

2.1 造模方法 改良后的Videman法左后肢伸直位固定制动法[4]：造模前动物禁食10～16 h，以3%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量耳缘静脉注射麻醉，剪去左后肢踝关节以上兔毛，牵拉使其处于完全伸直位，速干型石膏绷带经65～85 ℃热水浸泡软化后，从腹股沟到趾头固定(膝关节伸直180°，踝关节背屈60°),留出足趾观察血供，石膏绷带外用弹力医用绷带固定防止兔撕咬，共制动6周[5]。如足趾有坏死倾向，立刻拆除石膏绷带,待肿胀消退后再重新固定。若石膏绷带松动或脱落及时重新固定。造模满6周(造模后6周)时从各组动物随机抽取1只处死，取关节软骨作病理观察，可见病变关节软骨浅表区粗糙或有炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常，表现为细胞数目减少或簇聚，造模成功后将所有动物石膏固定拆除。

2.2 干预处理与取材 1)干预处理。空白组：正常饲养。模型组：造模后正常饲养。电针组：造模后6周起，电针KOA兔左侧“正极：阳陵泉，负极：阴陵泉”和“正极：内膝眼，负极：外膝眼”。取穴参照《实验针灸学》并结合动物比较学方法，根据比较解剖取穴法结合模拟骨度取穴法，选取膝关节上述腧穴进行治疗。以韩氏穴位神经刺激仪行电针刺激治疗，分别连接阳陵泉和阴陵泉，内膝眼和外膝眼。波形疏密波，频率2/100 Hz，强度3 mA，每次20 min。隔日治疗1次，1周3次，共6周。针刀组：造模后6周起,兔膝关节左侧针刀进针部位,以龙胆紫定位，常规备皮、消毒，然后刺入针刀，出针并按压片刻止血。每周1次，共6次。选用HZ系列一次性针刀，各进针点具体操作如下。①内、外侧副韧带进针点操作:针刀于韧带中点前缘进针，刀口线与韧带方向平行，刀体与皮肤切面垂直刺入，向韧带起、止点方向分别松解5次，出刀并加压片刻。②髌韧带进针点操作:刀口线与髌韧带纵轴平行，刀体和髌韧带皮肤切面垂直，快速剌入达髌韧带下,由上而下松解5次，出刀并加压片刻。圆利针组：造模后6周起，常规备皮、消毒，进针点与针刀组相同，松解5次。一次性圆利针，每周1次，共6次。2)取材。所有干预结束1周后,采用空气栓塞法处死动物，打开膝关节腔，肉眼观察KOA兔膝关节周围韧带、滑膜、关节囊、关节液等一般表现,并以彭太平法组织病理学分级标准分级[6],并迅速取矢状位在股骨外侧髁切取2 mm×3 mm×5 mm大小的带有软骨下骨质的软骨标本2块，一块标本置于4%多聚甲醛溶液进行组织固定，用于HE染色光镜观察；另一块标本置于2.5%的戊二醛进行组织固定,用于扫描电镜检测。3)数据处理和结果分析。采用光学显微镜下观察实验性KOA兔关节软骨潮线及间隙、钙化层及深层软骨改变情况，并于扫描电镜下观察关节软骨表面超微结构变化。使用SPSS 18.0统计分析软件进行统计分析，并对各组之间进行比较，计数资料用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 彭太平法组织病理学分析结果 根据彭太平法组织病理学分级，大体观察各组兔膝关节周围韧带、滑膜、关节囊、关节液的一般表现，结果见表1。

表1 各组兔彭太平关节软骨分级法对各组兔膝关节评分

注：与正常组相比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.2 关节软骨HE染色结果 见图1～5。

图1 正常组

图1为正常组兔左侧膝关节软骨HE染色放大100倍。镜下可见：关节软骨厚度正常，软骨表面光滑、连续，软骨细胞形态正常，均匀呈柱状排列，潮线清晰完整，无血管翳生成。

图2 模型组

图2为模型组KOA兔左侧膝关节软骨HE染色放大100倍。镜下可见:关节软骨层状结构消失，软骨表面细胞破损严重、出现大量剥脱缺损深达潮线，表层软骨细胞稀少，细胞排列呈无序状，层次紊乱，软骨细胞巢居，潮线模糊、断裂、甚至消失，部分软骨有少量血管翳生成。

图3 针刀组

图3为针刀组KOA兔左侧膝关节软骨HE染色放大100倍。镜下可见:关节软骨厚度正常，软骨表面较光滑、连续，软骨细胞形态总体正常，均久呈柱状排列，潮线较清晰完整，部分潮线模糊，有少量血管翳生成。

图4 电针组

图4为电针组KOA兔左侧膝关节软骨HE染色放大100倍。镜下可见:关节软骨厚度变薄，软骨表面欠光滑、出现少量剥脱缺损，部分深达潮线，表层软骨细胞较正常组增多，部分细胞排列呈无序状，层次紊乱较严重，软骨细胞巢居，部分潮线模糊、断裂，有少量血管翳生成。

图5 圆利针组

图5为圆利针组KOA兔左侧膝关节软骨HE染色放大100倍。镜下可见:关节软骨厚度接近正常，软骨表面较光滑、出现少量剥脱缺损，部分深达潮线，表层软骨细胞较正常组减少，部分细胞排列呈无序状，层次稍紊乱，软骨细胞巢居，部分潮线模糊、断裂，有少量血管翳生成。

3.3 关节软骨扫描电镜观察结果 见图6～10。

图6 正常组

图6为正常组兔膝关节软骨扫描电镜下放大5 000倍。镜下可见:软骨表面光滑，有凝胶样物质无定形物质均匀覆盖，其下胶原纤维结合成束，呈波纹状结构与沟纹相间并规则排列，具有典型的拱形结构，其垄部和沟部相互平行，波峰间距均等。

图7 模型组

图7为模型组KOA兔膝关节软骨扫描电镜下放大5 000倍。镜下可见:软骨表面破损严重，表面结构改变最为明显，裂隙增宽、加深，部分胶原纤维裸露，部分软骨基质丢失，垄沟排列基本消失，有大量裂缝，表面凝胶样物质大量剥脱并有岩石样凝胶颗粒附着，大量胶原纤维暴露、断裂撕脱呈网状，部分翻起，并排列紊乱。

图8 针刀组

图8为针刀组KOA兔膝关节软骨扫描电镜下放大5 000倍。镜下可见:软骨表面欠光滑，垄沟排列变浅，垄沟状排列尚隐约可见，表面小凹陷，无定形物部分消失，代之以纤维素样物质， 未见凝胶样物质剥脱掀起，胶原纤维尚未暴露，并出现微孔。

图9 电针组

图9为电针组KOA兔膝关节软骨扫描电镜下放大5 000倍。镜下可见:软骨表面粗糙，裂隙增宽、加深，部分胶原纤维裸露，部分软骨基质丢失，垄沟排列变浅，凝胶样物质剥脱掀起，部分胶原纤维裸露、松散，甚至断裂，粗细不均，并出现微孔。

图10 圆利针组

图10为圆利针组KOA兔膝关节软骨扫描电镜下放大5 000倍。镜下可见：软骨表面欠光滑，垄沟排列变浅，垄沟状排列尚隐约可见，表面小凹陷，无定形物部分消失，代之以纤维素样物质，少量凝胶样物质剥脱掀起，有细小浅表裂缝，或呈皮疹样改变，并出现微孔。

4 讨论

针刀疗法、电针疗法、温针灸疗法、火针疗法、三棱针疗法等疗法在中医临床治疗膝骨性关节炎疗效显著，但机理研究尚为薄弱[7-8]。综合本实验关节软骨形态学变化可得出，制动的造模措施造成KOA模型兔关节软骨大体解剖以及超微结构的病理变化,印证了模型复制成功且稳定。针刀、电针和圆利针3种干预治疗措施能有效改善软骨的损害，从彭太平关节软骨评分、HE染色切片和扫描电镜结果示针刀组治疗效果优于圆利针和电针组，电针组和圆利针组相比,圆利针组改善较佳。这与嵇波[9]、覃蔚岚[10]等学者的研究结果一致，针刀松解术可减缓KOA软骨的退变,可促进软骨表面形成新生纤维组织和骨祖细胞的形成，有形成软骨母细胞的趋势。从形态学指标变化，可示针刀和圆利针以关节周围阿是穴(主要是肌肉韧带的起止点)为主要刺激部位的松解针刺法的总体效果优于以腧穴特异性指导下的电针取穴治疗，进一步印证了《灵枢·经筋》提出的经筋病“以痛为输”的治疗原则，也进一步说明了针刀、圆利针通过松解病变关节周围的肌肉、肌腱及韧带等软组织(即筋肉)，即通过“调筋治骨”恢复关节周围的“筋骨平衡”，达到治疗效果的科学性。

膝骨关节炎不仅发生关节软骨损伤，同时还累及整个关节，包括关节周围肌肉、肌腱、韧带、软骨下骨、关节囊和滑膜，最终发生关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害。KOA关节的病理变化可看做关节周围软组织以及骨关节系统反应性结构损害与修复的过程，无论在病程发展还是干预治疗的过程中，病变关节部位的退行性变与组织修复始终伴行。对此,国外近10年来进行了卓有成效的研究，并初步提出肌肉功能障碍学说与KOA发生发展的关系问题。由于KOA破坏的终端在软骨和骨组织，因此许多研究集中于软骨的损害与修复，对于膝关节周围软组织的关注较少，但软骨乃至骨病变发生于过度的机械负荷是关节受到的原有应力平衡打破导致的最终结果。相关研究[11]认为,针刀疗法可使KOA兔膝关节软骨细胞破坏程度和胶原纤维的紊乱程度明显减少，对动物中枢水平的β-内啡呔及血清的炎性细胞因子有良性调节作用。目前实验研究大多集中于软骨损害却忽视了KOA早期的肌肉、韧带损伤等病理基础，或者可以说，肌肉等软组织的损伤是膝关节软骨损伤的前提和原因，也就是说中医学所说的“筋”即肌肉、韧带等软组织的损伤发生于KOA早期。

“膝为筋之府”,根据中医骨伤科文献提出的“筋骨并重”等相关理论，针刀松解法对KOA的治疗以调筋治骨为基本原则。有学者认为膝关节炎与“筋伤”关系密切，急、慢性损伤性应力造成膝关节周围软组织(经筋)损伤，引起劳损点黏连进而引发软骨退变、关节囊肥厚、骨赘增生等病变。因“伤筋而损骨”，并形成二者之间的恶性循环，破坏了膝关节的力学平衡，也就是改变了经筋“束骨而利机关”的作用，使膝关节出现力学平衡失调，从而使关节软骨的形态功能发生退变，最终导致KOA的发生。因此，膝部经筋的力学因素在KOA的发病中起着非常重要的作用，故以针刀松解法为代表的“调筋治骨”思路的作用机制值得探讨。

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