CLSM 技术在纤维表面形态和纸张结构研究中的应用

1 共聚焦激光扫描显微镜

与传统光学显微镜不同，CLSM采用激光照射样品的某一点并同时成像。受衍射控制的激光光点的尺寸决定了图像的分辨率，因此，CLSM比传统光学显微镜有更高的横向 (XY向)分辨率，同时可用数字图像处理技术改善图像的信噪比 (S/N)和对比度。

CLSM最大的特点是可以提供“光学切片”。激光透过物镜形成共聚焦平面，共聚焦平面以外的大部分散射光、反射光或荧光都被针孔过滤掉，不会进入光电检测器，其成像示意图见图1。如果物体比较厚，则只有一个薄层可以形成清晰的图像，即样品横截面的二维图像，且针孔的过滤作用确保了图像的信息只来源于该薄层，同时“光学切片”对样品本身不会造成任何损伤。利用CLSM自带的软件，把一系列的二维图像叠加起来，通过重组即可得到物体的三维图像［3］。

图1 CLSM的成像示意图［4］

CLSM图像的基本模型是XY平面，或样品共聚焦面的截面。CLSM和LM的区别是:CLSM只接收共聚焦平面的信号，因此，得到的图像仅是一个平面，而不是样品物体的全部，但LM镜头内物体表面反馈的全部信号都能被接收到。CLSM通过变换沿着高度方向上的共聚焦平面，可以得到一系列的共聚焦图像，即所谓的“光学切片”，如图2(a)所示。借助于软件，这些“光学切片”被叠加起来，就可以重组物体的三维图像，如图2(b)所示。同样，CLSM也可扫描XZ或YZ平面。当扫描XZ平面时，可以得到沿着纤维方向上的横切面，如图3(a)所示;当扫描YZ平面时，可以得到纤维的横截面，如图 3(b)所示［5］。

图2 桉木BCTMP浆纤维的CLSM图［5］

图3 纤维横切面的CLSM图

作为一种荧光检测手段，CLSM观测时需要对样品进行荧光染色。其主要的制样步骤如下:①配制染色剂溶液;②在避光状态下对样品进行充分染色;③洗掉样品表面的浮色;④制备样品玻片，即可进行观察检测。在避光保存的条件下，样品玻片可以重复使用。

从20世纪80年代至今，CLSM的类型和功能不断更新，已经出现了一系列的CLSM，如视屏CLSM、双光子CLSM、4Pi共聚焦激光显微镜、多焦点多光子共聚焦激光显微镜等。本文主要围绕传统CLSM在纤维形态和纸张结构研究中的应用展开论述。

2 共聚焦激光扫描显微镜的应用

2.1 纤维的形态

纸浆纤维的形态主要包括纤维的长度、宽度、粗度、细胞壁厚度和壁腔比等指标。这些参数是评价纤维品质的重要依据，纤维品质的好坏不仅影响纸浆的品质，还直接关系到成品纸张的品质［6］。纤维长度和粗度对纸张的抗张强度、撕裂强度和耐破度有重要影响。纤维细胞的壁腔比对纸张性能的影响极大:细胞壁较厚的纤维不易打浆，纤维间的结合较差，形成的纸张物理强度性能较弱，但纸张的松厚度高，吸水性好;细胞壁薄而细胞腔大的纤维比较柔软，容易压溃，可以抄造出强度较高、紧度较大的纸张。运用CLSM技术进行纤维形态观测时，首先需要对纤维样品进行荧光染色，待荧光染料吸附到纤维表面上后洗掉多余染料，然后把样品放在载物台上观察即可［7］。利用“光学切片”和图像分析技术可以分析纤维的长度、横截面积和细胞壁厚度等，如图2(b)所示。

Jang等人［4］利用CLSM得到了未漂硫酸盐针叶木浆纤维和微球体横截面的荧光图像。结果表明，利用CLSM技术可以对样品的横截面积进行定量的测量;采用微量的吖啶橙 (AO)染色可以获得最佳的纤维共聚焦图像;结合共聚焦技术和图像分析技术可以测定纸浆中纤维横截面积的大小和纤维粗度的分布。丁上骏［8］运用CLSM技术观测化学机械浆纤维表面形态，指出打浆增加了细小纤维和纤维碎片的含量，纤维细胞壁的P层、S层逐渐被破除，纤维的长度和粗度均下降，而纤维的柔软可塑性增加。YAN等人［9］利用ImageJ软件把纤维横截面的CLSM图像进行二值化处理，得到了纤维长度、粗度和细胞壁厚度的数据，进而用于分析纸浆纤维的成纸性能。

2.2 纤维表面的木素

植物纤维原料主要由纤维素、半纤维素和木素组成。在制浆过程中，利用化学或机械的方法，使纤维彼此分离。化学浆和化学机械浆有本质的区别，化学机械浆的纤维中仍保留大量的木素，对纤维本身的性能和纸浆整体质量均有负面影响，因为木素能够降低纤维的可再湿性、柔韧性和润胀性能，阻碍纤维间的结合以及纤维和化学品之间的连接。Koljonen等人［10］指出木素和抽出物在纤维表面呈颗粒状或薄膜状分布，颗粒直径的大小与制浆方法有关，而纤维素则呈微细纤维状分布在纤维表面。

有研究表明［11］利用CLSM技术观测纤维表面的木素，CTMP浆纤维表面分布着大量颗粒状物质，这些颗粒状物质是制浆后残存的木素或者抽出物。不论是木素还是抽出物，都具有憎水性，会阻碍纤维间的结合，降低纸张强度。丁上骏［8］利用番红 (Safranin O)对桉木CTMP浆纤维进行染色，通过CLSM观察打浆对纤维表面木素含量的影响。结果表明，随着打浆转数的增加，纤维整体和表面的荧光强度呈下降趋势，即总木素和表面的木素含量下降，同时纸浆的抗张强度明显提高。

当纤维与纤维之间的结合形成纤维网络时，首先是纤维的表面相互接触，因此，纤维表面的化学成分对纤维间的结合有更重要的影响。木素作为憎水性物质，覆盖在纤维表面，阻隔纤维表面羟基之间的结合和氢键的形成，进而降低纤维间的结合强度。王宝玉等人［12］结合AFM和CLSM分析纤维表面的木素，结果表明，如果CTMP浆纤维全部为纤维素，纤维与纤维之间的作用力即纤维素间的黏附力是28.7 mN/m;而当CTMP浆纤维全部由木素构成时，木素之间的黏附力仅为2.48 mN/m;纤维表面的木素浓度是纤维整体木素浓度的两倍;内部结合强度 (IBS)与纤维表面木素的浓度有线性关系，随纤维表面木素覆盖率的增加而降低。Li等人［13］利用CLSM定性分析了木素在纤维表面的分布，CLSM图像表明未漂硫酸盐杨木浆纤维表面的木素浓度是纤维整体木素浓度的2～3倍，而且木素在纤维表面分布不均匀，主要富集在纤维外表面、纤维壁内表面和细胞壁孔洞中。

利用CLSM观测纤维表面的木素时，通常需要添加不同的荧光染料，如吖啶橙、天青B、黄连素和孔雀绿等，其中吖啶橙荧光效果最佳［14-15］。丁上骏等人［8］用星蓝和番红分别标记纤维上的纤维素和木素，结果表明，CTMP浆纤维中的纤维素主要集中在纤维内部，而纤维细胞壁外表面以及细胞内腔表面的木素含量都比细胞内腔的高。同时也可以利用不同的荧光染料对不同的纸浆纤维进行荧光染色，如图4所示［16］。

图4 漂白麦草浆和桉木高得率浆纤维分布的CLSM图

2.3 纤维的形变性

在纸浆纤维的诸多特性中，纤维的柔韧性是纤维最重要且最基础的一个性质。在纸张成形过程中，纤维的柔韧性会影响纤维内部的网络结构，决定了纸张的大部分性质，如纸张的松厚度、透气度、不透明度、表面粗糙度和物理强度等［17］。Steadman等人［18］的研究指出，纸张的紧度和纤维的柔韧性有良好的线性关系，更重要的是当纤维比较挺硬时，纸张的紧度随纤维柔韧性的变化会更加敏感。因此如果利用机械浆代替硫酸盐浆进行生产，机械浆纤维的柔韧程度就变得尤为重要。机械浆的添加可以降低生产成本，提高纸张松厚度，但其较差的柔韧性会限制纤维之间的结合，容易导致纸张表面粗糙［19］。

纤维的柔韧性是影响纤维内部结合强度的重要因素，决定着纸张的强度性能。Steadman等人［18］提出利用纤维的适应性能可以评价纤维的柔韧性。Li等人［5］借助于CLSM对纤维的形变图进行扫描，如图5所示。用数学软件Matlab加工处理，通过低通滤波器使CLSM图平滑化，最后转化为二值化图像，这样既可以提高测量的精确度又避免了主观误差。由图5可以看出，LM测量的是纤维和载玻片表面的接触点到支撑线中心的距离L'，CLSM可以测量纤维中轴线的最低点到支撑线中心的距离L，且二者的测量结果相差较大。与化学浆纤维相比，机械浆纤维更加挺硬，纤维壁更厚，如果采用Steadman理论计算纤维的柔韧性，同时不能忽略机械浆细胞壁的厚度，那么需要测量的应该是纤维中轴线最低点到支撑线中心的距离L。实验结果表明，CTMP浆纤维的柔韧性与纤维间的结合强度和纸张的抗张强度有很好的相关性，漂白和打浆可以增加纤维的柔韧性。

图5 纤维横截面的二值化图

在纸张生产过程中，压榨、干燥和压光等操作会引起纤维形变最终导致纤维被压溃。压溃作用使纤维间的结合更加紧密，纸张的内部结合强度更好，纸张的物理强度性能得到提高。压榨导致纤维的变形分为两种，一种是纤维的柔顺性引起的弯曲形变，另一种则是由于压溃作用而发生的剪切形变，通常剪切形变贡献着纤维的大部分变形［20］。Li等人［5］利用 CLSM获得纤维的横截面图，研究分析了不同纸浆纤维的压溃能力 (见图6)。由图6可以看出，薄壁的云杉BKP浆纤维很容易发生完全的压溃;即使经过湿压，厚壁的桦木BCTMP浆纤维也有部分的压溃。另外，相比于化学机械浆，化学浆有更大的压溃系数。

2.4 纸张结构

纸张是一种多相、非均质、非均匀分布且具有三维结构的网状物材料。在纸张Z向上，纤维、涂层、填料与孔隙的结构和形态不同，这种差异会直接影响到纸张的最终性质，如内结合强度、光学性能以及油墨吸收性能等。纤维在纸张的纵向 (MD)、横向(CD)以及厚度方向 (ZD)上存在着排列不均匀性，从而使纸张的物理性能呈三维异向性。纸张的三维多孔结构直接决定了纸张的紧度和光学性能，通过相对结合面积 (RBA)间接决定了纸张的机械性能和尺寸稳定性。纸张的内部孔隙影响纸张的紧度、物理性能以及白度等;纸张的表面孔隙影响纸张的平滑度、涂布情况以及印刷性能等。

利用SEM观察纸张横截面的技术已经相当成熟，但是该技术需要对纸张进行包埋切片处理，步骤繁琐;利用CLSM的“光学切片”技术，不需对纸张进行切片处理，制样简单，且不损伤样品。Somwang等人［21］利用CLSM观察细小纤维在纸张结构中的分布，如图7所示。结果表明，细小纤维不仅覆盖在长级分纤维表面，还填充在长级分纤维结合的区域，可以进一步提高纸张的结合强度。借助CLSM，Moss等人［22］也发现通过添加细小纤维可以提高长级分纤维手抄片的紧度和抗张强度。ZHANG等人［23］利用CLSM观察到纸张表面涂布壳聚糖对蜂蜡渗透有明显的阻碍效果，如图8所示。Ozaki等人［24］借助于CLSM研究了涂布对印刷性能的影响以及油墨在纸张中的分布和渗透情况。

图7 纸张结构的XY截面图和在点线处的XZ截面图

图8 纸张横截面的CLSM图［23］

图6 不同纤维横截面的CLSM图

3 结语

基于激光共聚焦技术和图像分析技术，采用共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM)可以获得样品的“光学切片”且不损伤样品，还可以直接给出样品的三维图像，具有很高的横向 (XY向)分辨率和信噪比。借助于CLSM，可以更直观地检测纤维细胞壁的厚度和横截面的面积，分析纤维表面木素的含量和分布，研究纤维的柔韧性能和压溃性能，观察纸张的表面和内部结构，探究涂料和油墨在纸张表面的分布和渗透情况。从长远来看，优于传统光学显微镜的CLSM在纤维形态和纸张结构的研究中将会有更广泛的应用。

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