人脑胶质瘤组织中微小RNA-21与磷酸酶和张力蛋白同源基因的表达及其临床意义

薛飞 沈照立 沈睿 陈先震

[摘要] 目的 初步探索microRNAR-21（miR-21）与磷酸酶和张力蛋白同源蛋白（PTEN）基因在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义。 方法 采用RT-PCR检测215例胶质瘤（胶质瘤组）和50例正常人脑组织（对照组）中miRNA-21的表达水平，采用SP免疫组化法检测PTEN蛋白的表达情况，并探讨二者在胶质瘤组织中表达的相关性。 结果 miR-21在胶质瘤组中的相对表达量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明显高于对照组织（1.064±0.126），差异有统计学意义（P < 0.05）。PTEN在对照组中的表达率（100.00%）高于胶质瘤组（49.30%），差异有统计学意义（P < 0.05）。胶质瘤组中miR-21的表达量与PTEN在胶质瘤组中的阳性表达率呈负相关（r=-0.448，P < 0.05）。 结论 miR-21在胶质瘤组织中的表达升高，可能通过负性调节PTEN的表达，在胶质瘤的发生发展中发挥作用，二者的表达可以显示胶质瘤的恶性程度，通过检测二者在胶质瘤中的表达有助于评价胶质瘤的恶性程度和生物学行为。

[关键词] microRNAR-21；磷酸酶和张力蛋白同源蛋白；脑胶质瘤；相关性

[中图分类号] R739.41[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）04（c）-0036-04

Expression of micro RNA-21 and phosphatase and tensin homology gene in glioma and their clinical significances

XUE Fei SHEN Zhaoli SHEN Rui CHEN Xianzhen

Department of Neurosurgery, the 10th People's Hospital Afflilated to Tongji University, Shanghai 200072, China

[Abstract] Objective To investigate the expression of microRNAR-21 (miR-21) and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) in glioma and their clinical significances. Methods The expression of miR-21 was detected by RT-PCR in 215 glioma (glioma group) and 50 cases of normal brain tissues (control group). S-P immunohistochemical was used to detect the expression of PTEN. Results The expression of miR-21 (2-ΔΔCT) in the glioma group was (4.222±1.755), which was significantly higher than that in the control group (1.064±0.126), the difference was statistically significant (P < 0.05). The positive rate of PTEN protein in glioma group (49.30%) was lower than that in control group (100.00%), the difference was statistically significant (P < 0.05). There was negative correlation between miR-21 and the positive ratio of PTEN (r=-0.448, P < 0.05). Conclusion miR-21 might play an important role in the down-regulation of PTEN and development of glioma, the expression of two show the m alignant degree of glioma, it is helpfal to evaluate the m alignant degree and biologic behavior of glioma by detecting both expression.

[Key words] miR-21; PTEN; Glioma; Correlation

微小RNA（microRNA）是真核生物中一种长度约为20~22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过特异性识别并结合靶mRNA的3'非编码区（3'UTR）使靶mRNA降解，发挥其对基因的转录后调控，在细胞的生长、分化、凋亡及代谢等活动中发挥着重要作用[1]。最近几年的研究发现，MicroRNA在肿瘤的发生、发展和转移中同样起到非常重要的作用[2]，并有大量实验证据表明，微小RNAR-21（miR-21）在结肠癌、乳腺癌和膀胱癌等肿瘤细胞中的表达都表现出显著异常[3-5]，在胶质瘤表达的microRNA中，miR21表达水平升高最为明显[6]。通过计算机预测软件并经实验证实的miR21的靶基因包括：张力蛋白同源（PTEN）、PDCD4、RECK、TIMP3、Fasl、TRIP、Tap6、HNRPK及Spry2， 这些基因都发挥着抑制肿瘤生长的作用[7]。其中，磷酸酶和PTEN基因是具有磷酸酶活性的抑癌基因，其基因突变或缺失与多种恶性肿瘤密切相关[8]。miR21对PTEN的直接调控作用已经在胶质瘤、膀胱癌和胰腺癌中得到证实。目前尚没有对miR21和PTEN二者在胶质瘤中的表达相关性报道，考虑到miR21和PTEN在肿瘤发生发展中的重要作用，研究二者在胶质瘤组织中的表达及二者的相关性，为探讨miR21和PTEN作为肿瘤标志物的可能性提供重要依据，并为胶质瘤的诊断、治疗提供新的途径和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008~2012年同济大学附属第十人民医院（以下简称“我院”）神经外科胶质瘤患者手术切除的胶质瘤石蜡包埋组织标本215例为胶质瘤组，其中男118例，女97例，男女比例1.21∶1；年龄6~70岁，平均（47.50±2.21）岁。选择同期行脑外伤减压术的脑组织50例为对照组，其中男女比例为1.19∶1；年龄8~69岁，平均（46.30±2.03）岁。病例组与对照组年龄和性别差异无统计学意义（P < 0.05），具有可比性。所有患者均为原发，有详细的临床资料和手术记录，无其他严重并发症，且所有患者均为第一次手术治疗，术前均未行放、化疗及免疫治疗。所有患者或家属知情同意并签署知情同意书，本研究经过我院伦理委员会通过。

1.2 实验试剂

Trizol购自美国Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒及miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒购于北京天根生物技术有限公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；SP试剂盒、DAB试剂盒、苏木精染液及鼠抗人PTEN单克隆抗体均购自上海生工生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 组织总RNA提取用眼科剪将存于-80℃的组织剪碎，加入1 mL Trizol（将样品完全覆盖为宜），按照Trizol说明书提取组织中总RNA。应用NANO-DROP 2000超微量分光光度计进行检测，选择OD260/280为1.8~2.0的RNA于-80℃保存备用。

1.3.2 RT-PCR检测胶质瘤组织中miR-21的表达量取总RNA 0.5 μg，应用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，37℃反应60 min，-80℃备用。PCR扩增采用天根生物技术有限公司提供的miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行，上游引物根据试剂盒提供的设计方法进行设计，miR21的上游引物为：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，内参U6的上游引物序列为：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物由试剂盒提供。PCR扩增条件为：94℃ 2 min，40个循环：94℃，20 s，60℃，35 s。每个反应设三个复孔，记录每个反应的CT值，实验结果采用2-ΔΔCT表示胶质瘤组织中miR-21相对于正常人脑组织的表达倍数（相对表达量），其中△△CT=胶质瘤组织（CTmiR-21-CTU6）-正常脑组织（CTmiR-21-CTU6）。

1.3.3 SP法检测胶质瘤组织中PTEN的表达采用SP法进行PTEN检测，操作流程按照试剂盒说明书进行，用PBS作为阴性对照，已知PTEN阳性表达的胶质瘤标本作为阳性对照。PTEN阳性表达细胞均为细胞核或胞浆着色，呈棕黄色或黄褐色均匀颗粒状。在高倍显微镜下，每张切片均选择5个视野胶质瘤细胞密集区域进行观察，每个视野内计数100个胶质瘤细胞，阳性细胞数≥ 50%为强阳性（+++），25%~＜ 50%为阳性（++），5%~＜ 25%为弱阳性（+），＜ 5%为阴性（-）。阳性率=（各组总例数-阴性细胞数）/各组总例数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，采用Spearman等级相关分析miR21与PTEN表达量的相关性，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-21在胶质瘤组织和正常组织中的表达

胶质瘤组中miR-21的相对表达量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明显高于正常脑组织的对照组（1.064±0.126），差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1 两组miR-21的表达情况（x±s）

2.2 PTEN在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达

胶质瘤组中PTEN的表达率为49.30%，正常脑组织的对照组中PTEN的表达率为100.00%，PTEN在胶质瘤组中的表达率明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

表2 两组磷酸酶和张力蛋白同源基因的表达率情况

2.3 胶质瘤组织中miR-21与PTEN表达的相关性

对215例胶质瘤组中miR-21和PTEN的相对表达情况进行相关性分析，结果显示，胶质瘤组织中miR-21与PTEN的阳性表达呈负相关（r=-0.448，P < 0.05）。见表3。

表3 miR-21与PTEN在人脑胶质瘤组织中的表达相关性

注：PTEN：张力蛋白同源蛋白

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占颅内肿瘤的46%，恶性胶质瘤的发生率为（5~8）/10万[9]。胶质瘤呈浸润性生长，没有明显界限，手术无法完全切除。放疗、化疗不能特异性杀死胶质瘤细胞，并且对神经系统有严重的毒副作用。胶质瘤是神经外科领域的难题之一，至今没有突破性进展，且对其发生发展了解不够透彻。因此，阐述其致病机制、寻找新的治疗手段，对于攻克胶质瘤非常重要。

miR-21在多种恶性肿瘤中表达均升高，这些肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌及宫颈癌，并通过调节抑癌基因或细胞分化、凋亡相关的基因而促进肿瘤的发生发展。已经在胶质瘤鉴定出表达量恒定改变的miRNA，其中最显著的是miR-21。miR-21调控肿瘤生长机制的研究取得了一些进展，其中，miR-21在人乳腺癌细胞系MCF-7中通过调控程序性细胞死亡基因-4（PDCD4）抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖[10]。通过筛选人结肠癌miRNA表达谱中过表达的miRNA，发现miR-21的过表达和淋巴结转移程度高度相关[11]。PTEN是磷酸酶家族中发现的第一个有抑癌作用的基因，具有双磷酸酶活性，在细胞的迁移、黏附及胚胎正常发育中发挥重要的生物学功能，并在抑制肿瘤生长中也发挥重要作用。

Huang等[12]运用实时定量PCR和免疫组织化学染色，分析并对比了miR-21和PTEN蛋白在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达情况，研究结果表明miR-21在乳腺癌组织中表达水平高于对照组，而PTEN在正常乳腺组织中的表达水平高于乳腺组织中，并且miR-21与PTEN蛋白的表达在乳腺癌组织中呈负相关。有研究发现，miR-21在肝细胞癌组织及细胞株中均呈高表达；体外培养肝细胞癌细胞，敲低miR-21的表达后检测发现PTEN蛋白，发现其表达量增加，而肝癌细胞的增生、转移及侵袭能力却降低，可见PTEN作为miR-21的靶基因，其表达与miR-21呈负相关，在肿瘤细胞的增殖、侵袭中发挥重要最用[10]。以上研究表明，在肝癌和乳腺癌中PTEN是miR-21的靶基因，然而Hatley等[13]却认为在非小细胞肺癌中PTEN并不是miR-21的靶标，可见人们对于肿瘤中miR-21与PTEN的关系仍未达成共识。

本研究通过RT-PCR技术检测215例胶质瘤患者中miR-21的表达量，发现miR-21在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织。胶质瘤组织中miR-21的相对表达量为（4.222±1.755），正常脑组织中miR-21的相对表达量为（1.064±0.126），差异有统计学意义（P < 0.05）。对215例胶质瘤组织中miR-21和PTEN的表达情况进行相关性分析，结果显示胶质瘤组织中miR-21与PTEN的表达呈负相关（r=-0.448，P < 0.05）。miR-21在胶质瘤组织中的表达升高，可能通过负性调节PTEN的表达，在胶质瘤的发生发展中发挥作用。二者的表达可以显示胶质瘤的恶性程度，通过检测二者在胶质瘤中的表达有助于评价胶质瘤的恶性程度和生物学行为。

综上所述，本研究为PTEN作为miR-21的靶基因提供了新的依据，miR-21和PTEN的表达水平可以胶质瘤的恶性程度，通过检测二者在胶质瘤中的表达有助于评价胶质瘤的恶性程度和生物学行为。

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[13]Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，et al. Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21 [J]. Cancer Cell，2010，18（3）：282-293.

（收稿日期：2013-11-30本文编辑：任念）

[基金项目] 上海市科学技术委员会科研计划项目（编号12 ZR1423400）。

[通讯作者] 陈先震（1976-），男，副主任医师，副教授，硕士生导师；研究方向：显微神经外科微创治疗各种颅内肿瘤、脑血管病、脊髓肿瘤。