PPARγ C161→T、α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性 与原发性高血压的关系

张扬，邹晓译，刘双江，孙强，丁丽君，郝佳，赵君

论著·临床

PPARγ C161→T、α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性 与原发性高血压的关系

张扬，邹晓译，刘双江，孙强，丁丽君，郝佳，赵君

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)C161→T及α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性与原发性高血压(EH)的关系。方法原发性高血压患者(高血压组)262例与正常人群270例(健康对照组)为研究对象，应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法对PPARγ基因及α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性位点进行分析，统计2种基因多态性频率并进行比较。结果高血压组PPARγ C161→T基因型分布情况为TT型10例(3.82%)，TC型70例(26.72%)，CC型182例(69.46%)，T型等位基因为90例次(17.18%)，C型等位基因为434例次(82.82%)；健康对照组PPARγ C161→T基因型分布情况为TT型17例(6.30%)，TC型119例(44.07%)，CC型134例(49.63%)，T型等位基因为153例次(28.33%)，C型等位基因为387例次(71.67%)，2组间分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。高血压组α-内收蛋白Gly460Trp基因型分布情况为GlyGly型57例(21.76%)，GlyTrp型为129例(49.23%)，TrpTrp型为76例(29.01%)，Gly型等位基因为243例次(46.37%)，Trp型等位基因为281例次(53.63%)；健康对照组α-内收蛋白Gly460Trp基因型分布情况为GlyGly型63例(23.33%)，GlyTrp型为124例(45.93%)，TrpTrp型为83例(30.74%)，Gly型等位基因为250例次(46.30%)，Trp型等位基因为290例次(53.70%)，2组间分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论中国人群中PPARγ C161→T基因多态性与原发性高血压病相关；α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性与原发性高血压无相关性。

高血压，原发性；过氧化物酶体增殖物活化受体γ；α-内收蛋白；基因多态性

原发性高血压(EH)是遗传因素及环境因素综合作用引起的多基因遗传病，相关基因研究成为近年来关于EH研究的热点及重点。有研究发现高血压大鼠血压升高与内收蛋白有关，内收蛋白在调节跨膜离子转运与钠钾泵功能等方面起重要作用[1]；但不同人群研究得出的结论不一致；同时有研究表明活化的过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR) 可产生多种生物学效应，涉及的相关疾病有糖尿病、高脂血症、代谢综合征等，在血管病变中亦发挥作用[2]；而有关PPARγ C161→T基因多态性与原发性高血压的研究鲜有报道。本研究采用聚合酶链反应等方法同时探讨PPARγ C161→T、α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性与原发性高血压的关系[3]。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2003年6月—2004年11月我院心内科诊治原发性高血压患者262例(高血压组)，均符合1999年WHO/ISH指南的标准：(1)有明确高血压史且已服用抗高血压药物者；(2)未服用抗高血压药物，非同日2次收缩压≥140 mm Hg和/或舒张压≥90 mm Hg，排除继发性高血压、糖尿病、冠心病及严重肝肾功能障碍病史者。262例中男109例，女153例；年龄53～75岁；病程3～12年；有家族史48例，吸烟史86例；选择本院同期健康体检者270例为健康对照组，男116例，女154例；年龄53～74岁；有吸烟史76例；排除高血压、糖尿病、冠心病及肝肾功能障碍病史者。全部入选各受试者间无亲缘关系，均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器： PCR引物(上海英骏生物公司、上海生物工程技术服务有限公司合成),dNTPs、100 bp DNA marker、Taq plus DNA聚合酶、Promega琼脂糖、聚丙烯酰胺(北京鼎国生物公司)，限制性内切酶BbrpI(日本东洋纺公司)、Sau96 I(北京纽英伦生物技术有限公司)，GRADIENT基因扩增仪(Biometra公司)，Tanon Gis-1000凝胶成像系统(上海天能生物公司)。

1.2.2 基因多态性测定： 2组对象均采集外周空腹肘静脉血2 ml，注入含有EDTA的真空抗凝管中，缓慢摇匀，采用传统酚/氯仿法提取基因组DNA。

1.2.2.1 PPARγ基因多态性测定 (1)目的片断扩增：以基因组DNA作为模板进行PCR扩增，上游引物：5′-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3′；下游引物：5′-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3′。PCR反应体系25 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μl，基因组DNA 0.2 μg，Taq plus DNA聚合酶0.8 U。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 7 min。(2)PCR产物经限制性内切酶BbrpI酶切：20 μl酶切体系中，PCR产物7 μl，BbrpI 2 U，经37 ℃消化16 h。(3)电泳分离酶切产物：消化产物经质量分数2%琼脂糖凝胶电泳分离，由北京鼎国生物公司提供SSR DNA ladder作为DNA片段大小的标准物，于60 V恒压下电泳45 min，在紫外灯下可见3种不同片段大小的组合(见图1)。PPARγ基因6号外显子全长249 bp，其中第159～164位基因序列依次为CACGTG，是限制性内切酶BbrpI的酶切位点。如果第161位的C碱基突变为T碱基，则限制性内切酶BbrpI不能识别并酶切该位点，从而形成了限制性片断长度的多态性。如果第161位的是C碱基，该基因型称为CC型；若为T碱基，该基因型称为CT型或者TT型(即双链的2个基因拷贝均发生该位点突变)。PPARγ出现3种基因型：TT型200 bp；TC型200、120、80 bp；CC型120、80 bp。

图1 PPARγ基因片段电泳结果

1.2.2.2 α-内收蛋白Gly460Trp基因多态性测定 (1)目的片断扩增：上游引物：5′-CTCCTTTGCTAGTGACGGTGATTC-3′；下游引物：5′-GACTTGGCACTGCTTCCATTCGGC-3′。PCR反应体系20 μl，10×PCR buffer 2 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，基因组DNA 1 μl， RedTaq plus DNA聚合酶1 μl，dNTPs 0.5 μl。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 5 min。(2)PCR产物经限制性内切酶Sau96 I酶切：20 μl酶切体系中，PCR产物10 μl，Sau96 I 0.5 μl，经37 ℃消化16 h。(3)电泳分离酶切产物：消化产物经质量分数12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，后用硝酸银染色，经凝胶成像系统观察电泳图(见图2，其中GT和GG基因型的25 bp条带溢出胶外)。PCR扩增产物片段全长147 bp，经限制性内切酶Sau96 I识别并酶切产生3种酶切产物，从而形成了限制性片断长度的多态性。人类α-内收蛋白基因含17个外显子和16个内含子，第10外显子存在G614T位点突变，致编码该蛋白的460位甘氨酸(Gly)被色氨酸(Try)代替。野生纯合子GlyGly型为122，25bp；杂合子GlyTrp型为147，122，25bp；突变纯合子型TrpTrp型为147bp。

图2 Gly460Trp基因蛋白电泳结果

1.3 观测项目 记录受试者性别、年龄、体质量指数(BMI)、家族史、吸烟史、病程，同时测定其总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

2 结 果

2.1 临床资料比较 2组除血压外，性别、年龄、BMI、吸烟史比例、TG、TC、HDL-C、LDL-C比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组临床资料比较

2.2 PPARγ、α-内收蛋白基因型频率及等位基因频率比较 2组间PPARγ基因型分布频率及等位基因分布差异有统计学意义(P<0.05)，α-内收蛋白基因型分布频率及等位基因差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 2组PPARγ基因型频率及等位基因频率比较 [例(%)]

注：与健康对照组比较，*P<0.05

表3 2组α-内收蛋白基因型频率及等位基因频率比较 [例(%)]

3 讨 论

PPARγ主要存在于脂肪组织，并呈高表达，在脂肪细胞分化中扮演重要角色[2]，在免疫系统、肝脏、骨骼肌、心脏血管平滑肌细胞、内皮细胞、视网膜等组织细胞中呈低水平表达。PPARγ经配体激活后参与体内多种生理和病理过程，影响疾病发生、发展及预后。PPARγ激活后介导的生物效应主要包括脂类代谢、糖类代谢、炎性反应、免疫反应与细胞分化、凝血异常、内皮损伤等[4～6]。目前已发现PPARγ基因的多个突变位点，且突变基因之间的交互和对血压水平产生重大影响[4]。国内研究发现PPARγ C681G基因多态性与汉族人群中高血压病的发生有关[5]。国外研究发现PPARγ基因多态性与肾素水平有关，提示其基因多态性与高血压发病有关[7]。国内研究结果发现PPARγC161→T变异能减少颈动脉粥样硬化损害[8]。本研究结果显示，高血压组突变杂合子TC基因型和纯合突变TT基因型明显低于健康对照组，且2组等位基因分布频率差异有统计学意义。PPARγC161→T变异可能通过多个机制发挥其降压作用。约50%原发性高血压患者存在不同程度的胰岛素抵抗，新型抗糖尿病药物噻唑烷酮类(TZDs)作为PPARγ的合成配体，通过激活PPARγ，减轻胰岛素抵抗并增强胰岛素敏感性，发挥其降压作用；同时，TZDs还可刺激血管内皮细胞分泌C型钠尿肽，以自分泌或旁分泌方式作用于血管平滑肌，发挥其直接血管舒张作用；TZDs还能明显抑制内皮素-1分泌及过氧化氢等氧自由基生成，影响动脉弹性功能和结构。激活的PPARγ还可抑制单核—巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6和组织因子及血小板活化因子受体、血管细胞黏附分子1表达，限制慢性炎性反应，维持细胞膜通透性稳定，抑制平滑肌细胞兴奋—收缩耦联活性，减少平滑肌细胞的钙流入和钙敏感性，从而抑制血管收缩反应、平滑肌细胞增生与肥大、降低血管阻力，进而有效抑制压力负荷增加。研究结果表明，激活的PPARγ可通过蛋白质—蛋白质之间的相互作用抑制Sp1，从而在转录水平上抑制血管紧张素-II的1型受体(AT1R)，而血管紧张素-II作为肾素—血管紧张素—醛固酮系统的主要效应物质，是通过AT1R参与高血压发病与维持。因此，PPARγ C161→T变异通过上述机制更好地发挥降压作用。PPARγ C161→T基因多态性与原发性高血压病相关，该变异能降低个体罹患高血压的危险性，对此基因结构和功能调控的深入研究，将有利于进一步揭示高血压病的发病机制。

α-内收蛋白是一细胞膜骨架蛋白，多种细胞中均有α-内收蛋白存在，有诸多功能位点，参与细胞信号转导及细胞膜离子转运，与Na+的转运机制关系尤为密切[9]。国内外有研究探讨高血压与α-内收蛋白基因Gly460Trp多态性，但结论不一。多数研究关注盐平衡领域及神经内分泌调节领域。纳入10 960例中国人群的荟萃分析提示，中国人口混合民族α-adducin Gly460Trp基因多态性与EH易感性,汉族最强烈[10]。研究显示俄罗斯人口Gly460Trp基因的多态性是EH易感性基因,但其病理效应完全体现在环境因素的影响[11]。Ramu等[12]发现在南印度Tamilian人口Gly460Trp多态性不是原发性高血压的危险因素。Sciarrone等[13]研究发现，不同的EH患者中460Trp等位基因携带者血浆肾素水平不同，应用噻嗪类利尿剂降压治疗后，Trp460Trp基因型患者血压降低幅度更显著。考虑与该基因型患者肾脏钠盐调控机制受损，细胞内钠代谢和机体盐敏感性改变有关。本试验未发现α-内收蛋白基因Gly460Trp多态性与EH的相关性。分析结论产生分歧的原因：(1)不同种族基因型分布频率不同，存在种族差异；(2)生存环境、生活方式不同，即人群的基本特征不同，如我国南方人群及西方人群盐摄取量较我国北方人群盐摄取量明显为少，存在很多差异；(3)研究方法、统计方式及样本纳入研究对象的数量不同等导致研究结果产生分歧和差异。

原发性高血压的病因为多因素，通常认为是高血压遗传易感性和环境因素相互作用的结果，二者比例约为2∶3。对于诸多基因结构和功能调控的深入研究，将有利于进一步揭示高血压病的发病机制。同时高血压的病程较长，进展一般较缓慢，上述数种基因在高血压病始动、维持和加速等不同阶段的作用机制有待于进一步探讨。此外,大型和严格的病例对照研究,探讨基因—基因—环境交互可能产生更多的结论性的关于高血压的分子遗传学认识。

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TherelationshipbetweenthepolymorphismofPPARγC161→T,α-adducinGly460Trpandessentialhypertension

ZHANGYang*,ZOUXiaoyi,LIUShuangjiang,SUNQiang,DINGLijun,HAOJia,ZHAOJun.

*DepartmentofCardiology,theFirstHospitalofQinhuangdao,HebeiProvince,Qinghuangdao066000,China

ObjectiveTo investigate the relationship between peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) C161 → T, α-adducin gene Gly460Trp polymorphism and essential hypertension (EH).MethodsPatients with essential hypertension (hypertension group) were 262 cases, and 270 normal persons (control group) were enrolled in the research, using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism of loci PPARγ gene and α-adducin gene Gly460Trp analysis, analyzed the 2 kinds of gene polymorphism frequency and compared between them.ResultsIn hypertension group, PPARγ C161 → T genotype distribution as follows：10 cases of type TT (3.82%), type TC in 70 cases (26.72%), type CC in 182 cases (69.46%), the T allele was 90 cases (17.18%), C allele was 434 cases (82.82%); In healthy control group, distribution of PPARγ C161 → T gene type were TT type in 17 cases (6.30%), type TC in 119 cases (44.07%), type CC in 134 cases (49.63%), the T allele was 153 cases (28.33%), C allele in 387 cases time (71.67%), compared the difference of distribution between the 2 groups showed statistically significant (P<0.05). Hypertension group alpha-adducin Gly460Trp genotype distribution as follows：GlyGly type in 57 cases (21.76%), type GlyTrp in 129 cases (49.23%), type TrpTrp in 76 cases (29.01%), the Gly allele was 243 cases (46.37%), the Trp allele was 281 cases (53.63%); healthy controls' α-adducin Gly460Trp genotype distribution as follows：GlyGly type in 63 cases (23.33%), type GlyTrp in 124 cases (45.93%), type TrpTrp in 83 cases (30.74%), the Gly allele was 250 cases (46.30%), the Trp allele was 290 cases (53.70%), no statistically significant difference of distribution between the 2 groups were found (P>0.05).ConclusionChinese population with PPARγ C161→T gene polymorphism correlated with essential hypertension; no correlation between α-adducin gene Gly460Trp polymorphism and essential hypertension.

Hypertension,essential; Peroxisome proliferator activated receptor gamma; α-adducin; Gene polymorphis

066000 秦皇岛市第一医院心内科(张扬、邹晓译、孙强、丁丽君、郝佳、赵君)，急诊科(刘双江)

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.006

2014-02-24)