AKT、ERK1/2在下咽鳞状细胞癌中的表达及其相关性*

杨 珂 谷京城

AKT、ERK1/2在下咽鳞状细胞癌中的表达及其相关性*

杨 珂 谷京城△

目的探讨AKT和ERK1/2蛋白在下咽鳞状细胞癌组织及正常下咽黏膜组织中的表达。方法采用免疫组织化学SP法检测60例下咽鳞状细胞癌组织（鳞癌组）及15例正常下咽黏膜组织（对照组）中AKT和ERK1/2的表达情况，并分析2种蛋白与下咽癌临床和病理因素的关系及AKT与ERK1/2的相关关系。结果下咽鳞状细胞癌组织中AKT和ERK1/2的阳性表达率分别为78.3%(47/60)和66.7%(40/60)，明显高于正常下咽黏膜组织中的13.3%(2/15)和6.7%(1/15)，差异有统计学意义(P＜0.05)；组织分化程度越低，临床分期越晚，AKT和ERK1/2的阳性表达率越高，有淋巴结转移的癌组织中AKT和ERK1/2的阳性表达率较无淋巴结转移的癌组织高（P＜0.05或P＜0.01）。AKT和ERK1/2的表达呈正相关(rs=0.400，P＜0.05)。结论AKT和ERK1/2在下咽鳞状细胞癌中均高度表达，两者共同促进下咽癌发生、发展和浸润转移。

癌，鳞状细胞；下咽；下咽肿瘤；免疫组织化学；AKT；ERK1/2

下咽鳞状细胞癌（IHSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤，由于位置较隐蔽，不易早期发现，易早期出现淋巴结和远处转移，其诊断和治疗比较困难，临床常采用综合治疗，预后较差。研究IHSCC的发生和转移特性，为寻找肿瘤标志物和治疗靶点尤为重要。随着分子生物学的发展，AKT和ERK1/2在肿瘤研究中已引起人们的关注，但其在IHSCC中的研究较少。本研究通过比较AKT和ERK1/2在IHSCC组织及癌旁正常组织中的表达情况，进一步探讨两者在IHSCC的发生发展中的作用及其相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院耳鼻喉头颈外科2006年7月—2012年10月接受手术治疗并经病理证实为IHSCC的病理组织石蜡标本60例，为鳞癌组。其中高分化鳞癌24例，中分化鳞癌26例，低分化鳞癌10例。男58例，女2例，年龄43～85岁，平均60岁。根据2002年AJCC分期标准，T1～T2期11例，T3～T4期49例；有淋巴结转移46例，无淋巴结转移14例。另取15例癌旁安全切缘外的下咽黏膜标本（病理检查证实为正常下咽黏膜）作为对照组。所有标本均行HE染色并由两名有经验病理科医师阅片，证实IHSCC诊断。每例选择有代表性蜡块行常规切片。所有患者术前均未接受放疗、化疗等相关治疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化试剂及实验方法 鼠抗人AKT单克隆抗体（1∶200），鼠抗人ERK1/2单克隆抗体（1∶50），二抗使用生物素化羊抗鼠抗体,抗体均购自恩晶生物科技有限公司。常规SP法，烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，将准备滴加AKT抗体的切片进行柠檬酸微波修复，准备滴加ERK1/2抗体的切片进行柠檬酸高压修复，抗原修复后用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加抗体。DAB显色，流水充分冲洗，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，中性树胶封片后镜检。染色设阴性对照（以PBS代替一抗）。

1.2.2 免疫组化结果判定标准 细胞基本不着色为1分，中等着色为2分，强着色为3分。着色细胞占计数细胞百分率为0者，记0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，为阳性系数。0分者为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，大于4分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料比较采用χ2及校正χ2检验；两个变量相关性研究采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AKT和ERK1/2在2组中的表达 AKT在鳞癌组中阳性表达率为78.3%(47/60)，高于对照组的13.3%(2/15，χ2=19.607，P＜0.05)，阳性表达于细胞核和细胞质。ERK1/2在鳞癌组中阳性表达率为66.7%(40/60)，高于对照组的 6.7%(1/15，χ2=15.095，P＜0.01)，阳性表达于细胞核和细胞质。组织分化程度越低，临床分期越晚，AKT和ERK1/2的阳性表达率越高，有淋巴结转移的癌组织中AKT和ERK1/2的阳性表达率较无淋巴结转移的癌组织高（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

2.2 AKT和ERK1/2在鳞癌组中表达的相关性 AKT和ERK1/2在IHSCC组织中的表达呈正相关 (rs=0.400，χ2=15.095，P＜0.01)，见表2。

3 讨论

AKT是分子质量为57 ku的丝/苏氨酸蛋白激酶，通过下游的目标物质促进癌细胞生长和侵袭[1]。AKT活化的必要条件是苏氨酸(T308)和丝氨酸(S473)两个位点的磷酸化[2]。其磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，从而介导胰岛素、多种生长因子等诱发的细胞生长，经多种途径激活细胞，是重要的抗凋亡因子[3]。越来越多的证据表明，AKT的异常活化是在人类恶性肿瘤发生中最常见的分子事件之一，其表达水平与肿瘤的复发有关，可作为生物标志物[4]。AKT的抑制是癌症治疗策略[5]。本研究结果发现，AKT在IHSCC组织中高表达（78.3%），高于癌旁正常下咽黏膜组织中的13.3%，提示AKT在IHSCC的发生发展中起重要作用。组织分化程度越低，临床分期越晚，AKT的阳性表达率越高，有淋巴结转移的癌组织中AKT的阳性表达率较无淋巴结转移的癌组织高，说明AKT的活化可以促进肿瘤细胞的恶性增生、转化和转移。其机制可能是AKT被激活后抑制GSK3使细胞周期蛋白D水平增高，帮助细胞通过G1、S期检验点，进而促进肿瘤细胞的生长和侵袭[6]。因此，AKT可能是影响IHSCC恶性生物学行为和预后的重要因素。

Table 1 The relationship between the expressions of AKT and ERK1/2 protein and clinical and pathological characters in patients表1 病例组AKT和ERK1/2表达与临床病理参数之间的关系 例(%)

Table 2 The correlation between AKT and ERK1/2 in IHSCC表2IHSCC中AKT和ERK1/2表达的相关性（例）

ERK1/2是细胞外信号调节激酶，又称p44/p42丝裂原活化蛋白激酶，为信号转导的重要分子。ERK1/2信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶（MPAKs）信号转导通路家族的一条，参与细胞内激酶级联反应，使细胞外信号传递到细胞核内而调节基因表达等多种过程[7]。在恶性肿瘤细胞中，由于各种机制导致ERK过度活化，促进细胞增殖，抑制凋亡，促进细胞侵袭，影响细胞分化[8]。ERK1/2通路在调节细胞周期素D1表达中起重要作用，而细胞周期素D1是G1/S调控点的关键因子[9]。ERK1/2失活能够使细胞停滞于G1晚期，不能进入S期，过度活化则促进细胞增殖，促进肿瘤的发生。本研究结果表明，ERK1/2在IHSCC组织中的阳性表达率明显高于正常下咽黏膜组织。组织分化程度越低，临床分期越晚，ERK1/2的阳性表达率越高，有淋巴结转移的癌组织中ERK1/2的阳性表达率较无淋巴结转移的癌组织高，说明在IHSCC的发生、发展和转移中，ERK1/2的过度激活起到了重要的作用。

AKT和ERK1/2的激活均可对下游的细胞周期素D产生影响，进而影响细胞的活力、分化和增殖。本研究结果表明，AKT和ERK1/2在下咽鳞癌组织中的表达呈正相关关系，两者在肿瘤的生物学行为中有协同作用。对于AKT和ERK1/2活性升高的肿瘤，可采用RNA干扰或基因剔除技术，降低两者的表达，或者开发以AKT和ERK1/2靶点的抗肿瘤药物，检测两者在患者血液中的水平以评估预后，为发现、预防和治疗恶性肿瘤提供新的方向和思路。

[1] Pande S,Browne G,Stein G,et al.Oncogenic cooperation between PI3K/Akt signaling and transcription factor Runx2 promotes the invasive properties of metastatic breast cancer cells[J].J Cell Physiol,2013,228(8):1784-1792.

[2] Cicenas J.The potential role of AKT phosphorylation in human cancers[J].Int J Biol Makers,2008,23(1):1-9.

[3] Song G,Ouyang GL,Bao SD.The activation of AKT/PKB signaling pathway and cellsurvival[J].J Cell Mol Med,2005,9(1):59-71.

[4] Kremer CL,Klein RR,Mendelson J,et al.Expression of mTOR signaling pathway makers in prostate cancer progression[J].Prostate,2006,66(11):1203-1212.

[5] Jing H,Zhou X,Dong X.Abrogation of Akt signaling by Isobavachalcone contributes to its[J].Cancer Letters,2010(294):167-177.

[6] Cooper K,Herrington CS,Graham AK,et al.In situ evidence for HPVs16.18.33 intergration in cervical squamous cell cancer in Britain and South Africa[J].J Clin Pathol,2007,44(5):406-409.

[7] Chang LF,Karin M.Mammalian MAP kinas signaling cascades[J].Nature,2001,410:37-40.

[8] 张丽志,瞿全新.ERK信号转导通路对肿瘤细胞生物学行为的调控[J].医学综述,2011,17(6):836-838.

[9] Corona G,Deiana M,Incani A,et al.Hydroxytyrosol inhibits the proliferation of human colon adenocarcinoma cells through inhibition of ERK1/2 and CyclinD1[J].Mol Nutr Food Res,2009,53(7):897-903.

（2013-06-04收稿 2013-11-01修回）

（本文编辑 魏杰）

The Expression and Relationship of AKT and ERK1/2 Proteins in Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma

YANG Ke,GU Jingcheng
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

ObjectiveTo investigate the expressions of AKT and ERK1/2 proteins in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and normal hypopharyngeal mucosa.MethodsThe expressions of AKT and ERK1/2 proteins were examined by immunohistochemical S-P technique in 60 patients with hypopharyngeal squamous cell carcinoma and 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa.The relationship between expressions of AKT and ERK1/2 proteins and clinical pathological feathers was analyzed.ResultsThe positive rates of the expressions of AKT and ERK1/2 were 78.3%(47/60)and 66.7%(40/60)in 60 cases of hypopharyngeal squamous cell carcinoma,which were significantly higher than those in 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa[13.3%(2/15)and 6.7%(1/15),P＜0.05].The lower the degree of differentiation,the later the clinical stage,the higher the positive expression rates of AKT and ERK1/2.There were significantly higher expressions of AKT and ERK1/2 in patients with lymph node metastasis than those of patients without lymph node metastasis(P＜0.05 or P＜0.01).There was a positive correlation between expression levels of AKT and ERK1/2(rs=0.400，P＜0.05).ConclusionThere were higher expression levels of AKT and ERK1/2 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma.The activation of AKT and ERK1/2 proteins promotes hypopharyngeal occurrence,development and metastasis.

carcinoma,squamous cell;hypopharynx;hypopharyngeal neoplasms;immunohistochemistry;AKT；ERK1/2

R739.63 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.020

*辽宁省科学技术计划项目（项目编号：2009225010-39）

辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科

△通讯作者 E-mail：gjc20062006@126.com