宫颈癌侧群细胞的恶性行为特征分析*

李晓文 袁 俐 张俊平 李建勇 姜忠敏 盛 凤 刘晓智△

宫颈癌侧群细胞的恶性行为特征分析*

李晓文1袁 俐1张俊平1李建勇1姜忠敏2盛 凤3刘晓智3△

目的观察分析宫颈癌患者肿瘤干细胞样侧群细胞的恶性行为特征。方法取4例宫颈癌患者的宫颈癌组织，原代培养宫颈癌细胞，采用流式细胞术分离宫颈癌干细胞样侧群与非侧群细胞，MTT法绘制细胞生长曲线，Transwell培养体系比较两群细胞的侵袭能力，软琼脂克隆实验检测瘤细胞的克隆能力，免疫荧光方法检测耐药基因ATP结合体超家族成员2（ABCG2）的蛋白表达情况；于20只去胸腺小鼠腹股沟皮下接种两群细胞，各10只，比较其体内成瘤率。结果宫颈癌干细胞样侧群细胞占细胞总数的1.39%；与非侧群细胞相比，侧群细胞生长迅速，具有更强的瘤细胞侵袭力和克隆形成能力，且ABCG2的蛋白质表达水平更高。侧群细胞体内成瘤率为100%（10/10），而非侧群细胞为20%（2/10）；瘤体病理组织切片可见肿瘤形成，内部伴大片组织坏死。结论宫颈癌肿瘤干细胞样侧群细胞具有更高的恶性细胞表型，是未来宫颈癌基因治疗的核心靶点。

宫颈肿瘤；肿瘤干细胞；侧群细胞；侵袭；耐药性

宫颈癌是严重危害女性生命健康的疾病之一，其发病率居女性恶性肿瘤第2位，在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位[1]。如何改善宫颈癌的治疗效果，提高生存率是宫颈癌研究的一大难题[2]。近年来有研究认为，宫颈癌干细胞的存在是常规放射治疗以及化学药物治疗失败导致宫颈癌复发的根源[3-4]。但有关宫颈癌干细胞的鉴别、不同细胞亚群的恶性行为特征以及肿瘤细胞耐药性等问题仍存在争议。本研究通过对宫颈癌类干细胞样侧群细胞进行原代分离培养，并就其部分生物学特征进行观察，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源 选择2010年—2012年于我院妇产科行手术治疗的宫颈癌患者4例，年龄45～57岁。该研究均获得患者及家属同意，经医院伦理委员会讨论通过并登记。

1.2 试剂与动物 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培养基、胰蛋白酶（美国Invitrogene公司），胶原酶Ⅳ（Sigma公司），低熔点琼脂糖（北京鼎国公司）；兔抗人ATP结合体超家族成员 2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）多克隆抗体（美国Chemicon公司）。雄性20 g去胸腺小鼠20只，购自中国军事医学科学院动物中心，饲养于天津医科大学动物实验中心，饲养条件为SPF级，温度20～25℃，湿度（50±5）%。

1.3 宫颈癌细胞原代培养 取患者宫颈癌组织，于超净台中用D-Hanks液漂洗2次，剔除血管与坏死组织，剪切组织块至糊状，0.14%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶消化，移液器反复轻柔吹打细胞至单细胞悬液，10%胎牛血清培养基终止消化，100 μm筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清，收集细胞移至培养瓶中，以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素的DMEM/F12培养基在37℃、5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。原代培养3～5 d时行第1次换液，以后每3～4 d半量换液1次。

1.4 流式细胞术分选侧群细胞 取生长状态良好的肿瘤细胞进行流式细胞术检测，在细胞悬液中加入Hoechst33342至终浓度为5 mg/L，对照实验选择在加入Hoechst33342前加拮抗剂维拉帕米至终浓度50 mg/L，于37℃避光孵育90 min。1%多聚甲醛600 μL重悬，将制备好的细胞悬液入流式细胞仪检测。通过细胞分选，得到宫颈癌侧群细胞和非侧群细胞亚群。利用MTT方法绘制细胞生长曲线。

1.5 Transwell细胞侵袭实验 在Transwell上室铺基质胶，将侧群与非侧群细胞按1×104个/孔接种于Transwell上室，每种重复8孔，下室各孔分别加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基。48 h后取出上室，湿棉签拭去膜表面未穿过膜的细胞，苏木素染色，封片后80℃烘干。倒置显微镜下观察计数穿过膜的细胞数。

1.6 软琼脂克隆形成实验 6孔板孔底预铺置0.7%琼脂凝固，用终浓度为0.35%低熔点琼脂糖工作液分别与两群细胞悬液混匀，迅速加入6孔板中，培养箱中过夜凝固；次日每孔加入200 μL全培养基，3周后，倒置显微镜下随机取10个视野计数细胞数大于40的克隆团数，计算平均值。

1.7 免疫荧光方法检测耐药基因ABCG2的蛋白表达 将两群细胞分别进行细胞爬片，盖玻片预先用多聚赖氨酸包被，3 d后行免疫细胞荧光方法检测。以4%多聚甲醛固定，Triton X-100处理后，磷酸盐缓冲液平衡，山羊血清封闭30 min；吸去血清，滴加抗体工作液（1∶1 000），湿盒中4℃过夜；加入TRATIC荧光标记二抗，Hoechst33258复染，PBS和去离子水漂洗后，封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.8 体内成瘤率比较 调节两群细胞终浓度为1×105/μL，分别接种于20只去胸腺小鼠，各10只。接种时左手固定小鼠，于小鼠右腿与腹腔邻接部位碘伏消毒后，用50 μL微量注射器抽取单细胞悬液皮下潜行一段距离后匀速注入，留针1 min后，缓慢退出针头防止返液。接种后，置恒温[（25±2）℃]、恒湿（45%～50%）的无菌净化屏障系统内饲养，每日观察记录肿瘤生成和生长情况。细胞接种后28 d行肿瘤组织标本HE染色。

1.9 统计学方法 数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分选侧群细胞结果 宫颈癌干细胞样侧群细胞占细胞总数的1.39%，非侧群细胞占98.61%，见图1。

Figure 1 The cervical cancer stem cell-like side population cells isolated by flow cytometry图1 流式细胞术分选宫颈癌干细胞样侧群细胞

2.2 细胞生长曲线实验结果 宫颈癌干细胞样侧群细胞增殖速度较快，大致呈对数生长趋势，非侧群细胞则生长缓慢，无对数生长特点，见图2。

Figure 2 Comparison of growth curves between side population and non-side population cells of cervical cancer图2 宫颈癌侧群与非侧群细胞生长曲线图比较

2.3 Transwell细胞侵袭实验结果 宫颈癌干细胞样侧群细胞、非侧群细胞平均侵袭细胞数量分别为每高倍视野（46.1±7.4）、（1.4±0.3）个，侧群细胞高于非侧群细胞（t=19.732，P ＜0.01），见图3。

2.4 软琼脂克隆形成实验结果 宫颈癌干细胞样侧群细胞平均每高倍视野形成细胞数大于40的集落数为（13.5±3.4）个，非侧群细胞则仅见到极少个小细胞克隆团，未见到细胞数大于40的集落，见图4。

2.5 抗药基因ABCG2的蛋白表达 宫颈癌干细胞样侧群细胞中抗药基因ABCG2的蛋白质表达水平明显高于非侧群细胞，且主要表达于细胞胞浆和胞膜，见图5。

2.6 体内成瘤率比较 宫颈癌干细胞样侧群细胞在去胸腺小鼠皮下成瘤率为100%（10/10），而非侧群细胞为20%（2/10），且其肿瘤体积相对较小，见图6A。瘤体病理组织切片可见肿瘤形成，内部伴大片组织坏死，见图6B。

3 讨论

肿瘤干细胞是存在于肿瘤细胞系或肿瘤组织中，具有自我更新、多向分化潜能、高耐药性及高致瘤性等特点的一群细胞，约占肿瘤细胞总数的0.01%～2.00%，在肿瘤形成、生长、浸润、转移和复发中起着关键性的作用[5-6]。先后有研究在一些实体瘤，如肺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌等癌组织中分离获得了肿瘤干细胞[7]。但是从子宫颈癌组织中分离获得肿瘤干细胞的相关报道较少，对其生物学特性认识也有限。2004年Setoguchi等[8]从宫颈癌HeLa细胞株中分选出侧群细胞。宋菁华等[9]研究显示宫颈癌细胞中侧群细胞的比例约为（2.04±0.93）%。本研究从4例宫颈癌患者中分离培养得到宫颈癌细胞，并利用流式细胞术分选出宫颈癌干细胞样侧群细胞及非侧群细胞，宫颈癌干细胞样侧群细胞占细胞总数的1.39%，与宋菁华等[9]的研究结果基本一致。研究显示宫颈癌侧群细胞体外增生能力强于非侧群细胞[5,9]。本研究通过MTT实验发现宫颈癌干细胞样侧群细胞增殖活性明显高于非侧群细胞，其增殖活性旺盛，可长期传代；而非侧群细胞则增殖缓慢，无明显对数生长特点，与以上研究一致。结果还发现宫颈癌干细胞样侧群细胞具有更高的细胞侵袭和克隆能力。

肿瘤干细胞有别于一般肿瘤细胞的最显著特点是多药耐药性。研究证实其多药耐药性主要与一类细胞膜转运蛋白超家族的表达有关，此类膜蛋白均具有ATP结合盒式结构，并依赖此结构获得ATP供能后，将积蓄在癌细胞内的药物“泵”至膜外而形成药物耐受[10]。ABCG2是1998年发现的ABC膜转运蛋白超家族成员，由多药抗性蛋白基因和多药抗性相关蛋白基因编码。有研究显示ABCG2蛋白在宫颈癌标本组织中表达增高[11]。本研究结果表明宫颈癌干细胞样侧群细胞中ABCG2蛋白的表达水平明显高于非侧群细胞，提示ABCG2基因参与宫颈癌干细胞的多药耐药机制，并可作为基因靶向治疗的潜在靶点之一。本研究中宫颈癌干细胞样侧群细胞在去胸腺小鼠皮下成瘤率为100%，而非侧群细胞仅为20%，提示宫颈癌干细胞样侧群细胞较非侧群细胞具有更高的体内移植成瘤能力。

Figure 3 Comparison of invasive capacity between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=20 μm)图3 宫颈癌侧群与非侧群细胞侵袭能力比较（标尺=20 μm）

Figure 4 Comparison of clonogenic capacity between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=50 μm)图4 宫颈癌侧群与非侧群细胞克隆形成能力比较（标尺=50 μm）

Figure 5 Comparison of ABCG2 gene expression between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=20 μm)图5 宫颈癌侧群及非侧群细胞中ABCG2的蛋白表达比较（标尺=20 μm）

Figure 6 Comparison of subcutaneous tumor between side population and non-side population cells of cervical cancer in mice图6 宫颈癌侧群及非侧群细胞在去胸腺小鼠皮下成瘤对照

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（2013-05-01收稿 2013-10-24修回）

（本文编辑 陈丽洁）

The Analysis of Malignant Characteristics of Side Population Cells in Patients with Cervical Cancer

LI Xiaowen1,YUAN Li1,ZHANG Junping1,LI Jianyong1,JIANG Zhongmin2,SHENG Feng3,LIU Xiaozhi3
1 Department of Obstetrics and Gynecology，The Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300450,China；2 Department of Pathology；3 The Central Laboratory

ObjectiveTo analysis the malignant performance characteristics of tumor stem cell-like side population cells in patients with cervical cancer.MethodsThe cervical cancer cells were obtained from surgical resection tumor tissue.The tumor stem cell-like side population cells were isolated by flow cytometry.The cell growth curve was drawn by MTT assay.The invasion ability of tumor cells was compared by transwell assay.The clonogenic capacity was detected by clone formation in soft agar.The expression level of ABCG2 protein,a drug-resistant gene,was detected by immunofluorescence method.Finally,these cells were transplated into the subcutaneous of de thymus mice.The rate of tumor formation was compared between groups.ResultsThe results from flow cytometry assay showed the percentage of cervical cancer stem cell-like side population cells was 1.39%.Compared with the non-side population cells,the side population cells grow quickly,showed the enhanced invasion ability and colony forming ability.There was more high expression level in ABCG2 protein of side population cells.The tumor form rate was 100%(10/10)in the side population cells and the non-side population cells was 20%(2/10).ConclusionThe cervical cancer stem cell-like side population cells have more malignant performance characteristics than that of non-side population cells,which maybe a core target for cancer gene therapy in the future.

uterine cervical neoplasms;neoplastic stem cells;side population cell;invasion;drug resistance

R737.3 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.006

*滨海新区卫生局医药卫生科技基金项目（项目编号：2011BHKY007）

1天津市第五中心医院妇产科（邮编300450），2病理科，3中心实验室

△通讯作者 E-mail：lxz7997@126.com