纤维素酶微波法提取黄柏根色素及抗氧化性

黄秀香+赖红芳+荀元凯

摘要: 试验优化了纤维素酶微波法提取黄柏根色素的工艺条件及进行抗氧化性研究，以水为提取剂，通过正交试验优化得到黄柏根色素的最佳提取工艺为微波功率390 W，酶解温度50 ℃，酶解pH为4.5，微波时间120 s；抗氧化性研究表明，黄柏根色素对DPPH、羟基自由基具有一定的清除能力，且抗氧化能力随浓度增大而增强，是一种天然有效的抗氧化剂。

关键词: 纤维素酶；微波；黄柏根；色素；抗氧化性

中图分类号：S789.4；R284.2文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1888-03

Cellulase Assisted Microware Extraction and Antioxidant Activity of Pigment from the Root of Phellodendron

HUANG Xiu-xiang, LAI Hong-fang, XUN Yuan-kai

(Department of Chemistry and Life Sciences，Hechi University，Yizhou 546300， Guangxi ,China)

Abstract： The optimal technical parameters for extracting pigment from the root of Phellodendron by cellulase assisted microware and its antioxidant activity was studied. The results showed that the optimal conditions were microwave power of 390 W, enzymolysis temperature of 50 ℃, enzymolysis pH of 4.5, microwave time of 120 s, and using water as the extracting solvent. The results of antioxidation showed that pigment extracted from the root of Phellodendron had a certain scavenging effect on free radical of DPPH and hydroxyl radical. The reduction capability was increased with the increase of pigment concentration in experiment. Pigment from the root of Phellodendron was a powerful natural axtioxidant.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｍｉｃｒｏｗａｖｅ； ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｏｆ pｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ； ｐｉｇｍｅｎｔ； ａｘｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ

黄柏为芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮，黄柏根可入药，味苦，性寒，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等功能［1，2］。人们对黄柏根的研究主要集中在生物碱方面，对黄柏根色素研究不多。合成色素虽然着色力强，色泽鲜艳，但已发现部分品种对身体有危害，具有严重的慢毒性和致癌性［3］，为此，天然色素慢慢被人们所青睐［4］。黄柏根有着丰富的黄色素，可以给食品提供鲜美的颜色，增加食品的安全性。本研究首次以水为溶剂，纤维素酶微波法提取黄柏根色素，具有省时、溶剂耗量少、提取率高等优点［5］。纤维素酶能够有效地破坏植物的细胞壁，降低扩散阻力，加快传质速率，从而提高提取率［6］，同时酶解法较为温和、对环境友好［7］。此外，还对所提取的黄柏根色素进行抗氧化性研究，通过对DPPH、羟基自由基的清除能力来研究黄柏根色素的抗氧化能力，为黄柏根色素的提取、开发、利用提供了理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

黄柏根，购于广西宜州市药材市场。8453型紫外可见分光光度计（美国Agilent Technologies公司）， FZ102型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），EG823MF-NA型微波炉（广东美的微波炉制造有限公司），HH-6型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），AR224CN型电子天平（奥豪仪器有限公司），PHS-3B型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1黄柏根的预处理黄柏根去皮→粉碎→过筛（60目）→石油醚浸泡、脱脂→抽滤取滤渣晾干，得黄柏根粉末置于小塑封袋中，备用。

1.2.2纤维素酶微波法提取准确称取0.250 0 g黄柏根粉末于100 mL烧杯中，加入25 mL水，调节pH为5，放入50 ℃恒温水浴锅中作用30 min，然后煮沸，灭酶，冷却，在微波功率650 W条件下辐射（一次20 s，共8次，辐射完一次冷却2 min），辐射完成后趁热抽滤，定容，测其吸光度。

1.2.3单因素试验设计称取0.250 0 g粉碎的黄柏根粉末，纤维素酶微波法提取，分别考察酶解温度30、40、50、60、70 ℃，酶解pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，微波功率130、390、650、1 040、1 300 W，微波时间120、140、160、180、200 s各5个水平的单因素试验下，以吸光度为考察指标，确定各因素的取值范围。

1.2.4正交试验设计以酶解温度、酶解pH、微波功率、微波时间设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。

1.2.5抗氧化能力测定

1）清除DPPH能力以黄柏根色素与维生素C（以下简称VC）对DPPH的清除能力作对比。将黄柏根溶液和VC配制成0.012、0.024、0.036、0.048、0.060 mg/mL 5个浓度；准确称取4.0 mg DPPH样品，用无水乙醇溶解并定容于100 mL 容量瓶中，DPPH浓度为1×10-4 mol/L，避光保存。取2 mL样品溶液于10 mL 具塞试管中，加2 mL DPPH溶液，充分混合，静置30 min，在517 nm处测定吸光度，平行测定3次，取平均值，按下式计算清除率［8］。

DPPH清除率=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%

式中，Ai-样液与DPPH反应后的吸光度；Aj-只加样品未加DPPH的吸光度；Ac-未加样的DPPH的吸光度。

2）清除羟基自由基能力在5个10 mL容量瓶中加入1 mL 9 mmol/L的Fe2+，1 mL 9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液，再分别加入0.012、0.024、0.036、0.048、0.060 mg/mL的色素溶液1 mL，最后加入1 mL的8.8 mmol/L的H2O2［9］，以去离子水为对照，在510 nm处测吸光度，每个浓度测3次，取平均值，测定不同浓度色素对羟基自由基的清除能力。取VC溶液，按照上面的方法进行对照试验。 清除率=［1-（AX-AX0）］/A0×100%

式中，A0为不加样品空白液的吸光度；AX为加入样品的吸光度；AX0为不加显色剂H2O2 样品溶液的吸光度。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶解温度吸光度与酶解温度结果见图1。由图1可知，黄柏根色素吸光度随酶解温度的增大呈现先增大后减小的趋势，当温度太低时，纤维素酶活性低，使酶解不够充分，当酶解温度超过60 ℃时，过高温度使酶活性降低，达到一定温度，酶完全失去活性，即失活。

2.1.2酶解pH每一种酶催化活性都有一个最适宜的pH，由图2可知，酶解pH过低纤维素酶活性也较低，黄柏根粉末酶解不够充分，随着pH的升高吸光度也增加，当pH超过4.5后，酶活性降低，黄柏根色素吸光度下降。

2.1.3微波功率由图3可知，一定的微波功率对黄柏根色素的提取是有利的，功率太小，辐射能量不够，黄柏根色素析出不充分，而微波功率过大，由于辐射能量过大，会使色素结构遭到破坏，吸光度反而下降。

2.1.4微波时间由图4可知，黄柏根色素吸光度随微波时间延长呈先增大后减小的趋势，当微波时间为120 s时，微波时间太短，吸光度较小，在微波时间为140 s时吸光度最大，色素提取充分，当微波时间超过140 s以后，由于微波时间越长，使提取出来的黄柏根色素结构受到破坏，吸光度下降。

2.2正交试验结果

为探讨纤维素酶法微波提取黄柏根色素的最佳工艺条件，根据单因素试验结果设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。由表2可知，黄柏根色素的最佳提取条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s；其中微波功率影响最大，其次是微波时间，而酶解温度和酶解pH对试验影响较小。在正交试验的最佳条件下提取黄柏根色素，5次重复，测得平均吸光度为0.410，大于表2中的任何一项，平均相对标准偏差RSD为0.47%，表明该工艺可行。

2.3 抗氧化试验结果

2.3.1黄柏根色素清除DPPH从图5可以看出，黄柏根色素、VC在试验浓度范围对DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着浓度增加，清除率也逐渐增强。当浓度达0.060 mg/mL，黄柏根色素对DPPH清除率为62%，VC对DPPH清除率为73%，黄柏根色素在试验浓度范围内有较好的还原能力，但比VC稍差。

2.3.2黄柏根色素清除羟基自由基黄柏根色素和VC抗氧化剂均具有清除羟基自由基的能力（图6），当浓度为0.060 mg/mL时两者对羟基自由基的清除率分别为39%和45%，且在试验浓度范围，清除能力均随浓度的增大而增强，但黄柏根色素的清除能力比VC稍差。

3结论

试验采取纤维素酶微波法提取黄柏根天然色素，在单因素试验基础上进行正交试验，得出最佳提取工艺条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s，其中，微波功率对试验影响最大。抗氧化性试验结果表明，黄柏根色素在试验浓度范围对DPPH、羟基自由基的清除作用都呈量效关系，有较好的抗氧化能力，是一种天然有效的抗氧化剂。微波辅助纤维素酶提取黄柏根色素，以水作提取剂，具有操作简单、省时、节能、环保提取率高等多种优点。

参考文献：

［1］ 陈小利，吕俊芳，宁亚娣，等. 黄柏根中色素的提取与性质研究［J］．延安大学学报（自然科学版），2007，26（2）：57-59.

［2］ 安健，赵建平. 黄柏抗菌成分的提取及对真丝的抗菌性研究［J］．印染助剂，2008，25（6）：13-15.

［3］ 李永祥，詹少华，蔡永萍，等. 板栗壳色素的提取、纯化及稳定性［J］．农业工程学报，2008，24（9）：298-302.

［4］ 徐青海，明霞．天然色素的提取及其生理功能［J］．应用化工，2005，34（5）：268-270，273.

［5］ 何荣海，翟庆娇，仲晗实，等.微波辅助回流提取葵花籽粕绿原酸的研究［J］．中国粮油学报，2012，27（9）：107-111.

［6］ 魏凤玉，康家胜，张宇.纤维素酶法提取黄芪多糖的动力学［J］.过程工程学报，2012，12（5）：839-843.

［7］ 冯淑环，殷丽君，袁蕊，等. 酶法转化糖苷型沙棘叶黄酮生成苷元工艺优化［J］. 农业机械学报，2011，42（4）：127-132，138.

［8］ 吴峰华，罗志生，何志平，等. 山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究［J］.中国粮油学报，2011，26（8）：109-113，122.

［9］ 许平. 黄瓜多糖抗氧化活性研究［J］. 重庆工商大学学报（自然科学版），2009，26（1）：54-56．

式中，A0为不加样品空白液的吸光度；AX为加入样品的吸光度；AX0为不加显色剂H2O2 样品溶液的吸光度。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶解温度吸光度与酶解温度结果见图1。由图1可知，黄柏根色素吸光度随酶解温度的增大呈现先增大后减小的趋势，当温度太低时，纤维素酶活性低，使酶解不够充分，当酶解温度超过60 ℃时，过高温度使酶活性降低，达到一定温度，酶完全失去活性，即失活。

2.1.2酶解pH每一种酶催化活性都有一个最适宜的pH，由图2可知，酶解pH过低纤维素酶活性也较低，黄柏根粉末酶解不够充分，随着pH的升高吸光度也增加，当pH超过4.5后，酶活性降低，黄柏根色素吸光度下降。

2.1.3微波功率由图3可知，一定的微波功率对黄柏根色素的提取是有利的，功率太小，辐射能量不够，黄柏根色素析出不充分，而微波功率过大，由于辐射能量过大，会使色素结构遭到破坏，吸光度反而下降。

2.1.4微波时间由图4可知，黄柏根色素吸光度随微波时间延长呈先增大后减小的趋势，当微波时间为120 s时，微波时间太短，吸光度较小，在微波时间为140 s时吸光度最大，色素提取充分，当微波时间超过140 s以后，由于微波时间越长，使提取出来的黄柏根色素结构受到破坏，吸光度下降。

2.2正交试验结果

为探讨纤维素酶法微波提取黄柏根色素的最佳工艺条件，根据单因素试验结果设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。由表2可知，黄柏根色素的最佳提取条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s；其中微波功率影响最大，其次是微波时间，而酶解温度和酶解pH对试验影响较小。在正交试验的最佳条件下提取黄柏根色素，5次重复，测得平均吸光度为0.410，大于表2中的任何一项，平均相对标准偏差RSD为0.47%，表明该工艺可行。

2.3 抗氧化试验结果

2.3.1黄柏根色素清除DPPH从图5可以看出，黄柏根色素、VC在试验浓度范围对DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着浓度增加，清除率也逐渐增强。当浓度达0.060 mg/mL，黄柏根色素对DPPH清除率为62%，VC对DPPH清除率为73%，黄柏根色素在试验浓度范围内有较好的还原能力，但比VC稍差。

2.3.2黄柏根色素清除羟基自由基黄柏根色素和VC抗氧化剂均具有清除羟基自由基的能力（图6），当浓度为0.060 mg/mL时两者对羟基自由基的清除率分别为39%和45%，且在试验浓度范围，清除能力均随浓度的增大而增强，但黄柏根色素的清除能力比VC稍差。

3结论

试验采取纤维素酶微波法提取黄柏根天然色素，在单因素试验基础上进行正交试验，得出最佳提取工艺条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s，其中，微波功率对试验影响最大。抗氧化性试验结果表明，黄柏根色素在试验浓度范围对DPPH、羟基自由基的清除作用都呈量效关系，有较好的抗氧化能力，是一种天然有效的抗氧化剂。微波辅助纤维素酶提取黄柏根色素，以水作提取剂，具有操作简单、省时、节能、环保提取率高等多种优点。

参考文献：

［1］ 陈小利，吕俊芳，宁亚娣，等. 黄柏根中色素的提取与性质研究［J］．延安大学学报（自然科学版），2007，26（2）：57-59.

［2］ 安健，赵建平. 黄柏抗菌成分的提取及对真丝的抗菌性研究［J］．印染助剂，2008，25（6）：13-15.

［3］ 李永祥，詹少华，蔡永萍，等. 板栗壳色素的提取、纯化及稳定性［J］．农业工程学报，2008，24（9）：298-302.

［4］ 徐青海，明霞．天然色素的提取及其生理功能［J］．应用化工，2005，34（5）：268-270，273.

［5］ 何荣海，翟庆娇，仲晗实，等.微波辅助回流提取葵花籽粕绿原酸的研究［J］．中国粮油学报，2012，27（9）：107-111.

［6］ 魏凤玉，康家胜，张宇.纤维素酶法提取黄芪多糖的动力学［J］.过程工程学报，2012，12（5）：839-843.

［7］ 冯淑环，殷丽君，袁蕊，等. 酶法转化糖苷型沙棘叶黄酮生成苷元工艺优化［J］. 农业机械学报，2011，42（4）：127-132，138.

［8］ 吴峰华，罗志生，何志平，等. 山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究［J］.中国粮油学报，2011，26（8）：109-113，122.

［9］ 许平. 黄瓜多糖抗氧化活性研究［J］. 重庆工商大学学报（自然科学版），2009，26（1）：54-56．

式中，A0为不加样品空白液的吸光度；AX为加入样品的吸光度；AX0为不加显色剂H2O2 样品溶液的吸光度。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶解温度吸光度与酶解温度结果见图1。由图1可知，黄柏根色素吸光度随酶解温度的增大呈现先增大后减小的趋势，当温度太低时，纤维素酶活性低，使酶解不够充分，当酶解温度超过60 ℃时，过高温度使酶活性降低，达到一定温度，酶完全失去活性，即失活。

2.1.2酶解pH每一种酶催化活性都有一个最适宜的pH，由图2可知，酶解pH过低纤维素酶活性也较低，黄柏根粉末酶解不够充分，随着pH的升高吸光度也增加，当pH超过4.5后，酶活性降低，黄柏根色素吸光度下降。

2.1.3微波功率由图3可知，一定的微波功率对黄柏根色素的提取是有利的，功率太小，辐射能量不够，黄柏根色素析出不充分，而微波功率过大，由于辐射能量过大，会使色素结构遭到破坏，吸光度反而下降。

2.1.4微波时间由图4可知，黄柏根色素吸光度随微波时间延长呈先增大后减小的趋势，当微波时间为120 s时，微波时间太短，吸光度较小，在微波时间为140 s时吸光度最大，色素提取充分，当微波时间超过140 s以后，由于微波时间越长，使提取出来的黄柏根色素结构受到破坏，吸光度下降。

2.2正交试验结果

为探讨纤维素酶法微波提取黄柏根色素的最佳工艺条件，根据单因素试验结果设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。由表2可知，黄柏根色素的最佳提取条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s；其中微波功率影响最大，其次是微波时间，而酶解温度和酶解pH对试验影响较小。在正交试验的最佳条件下提取黄柏根色素，5次重复，测得平均吸光度为0.410，大于表2中的任何一项，平均相对标准偏差RSD为0.47%，表明该工艺可行。

2.3 抗氧化试验结果

2.3.1黄柏根色素清除DPPH从图5可以看出，黄柏根色素、VC在试验浓度范围对DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着浓度增加，清除率也逐渐增强。当浓度达0.060 mg/mL，黄柏根色素对DPPH清除率为62%，VC对DPPH清除率为73%，黄柏根色素在试验浓度范围内有较好的还原能力，但比VC稍差。

2.3.2黄柏根色素清除羟基自由基黄柏根色素和VC抗氧化剂均具有清除羟基自由基的能力（图6），当浓度为0.060 mg/mL时两者对羟基自由基的清除率分别为39%和45%，且在试验浓度范围，清除能力均随浓度的增大而增强，但黄柏根色素的清除能力比VC稍差。

3结论

试验采取纤维素酶微波法提取黄柏根天然色素，在单因素试验基础上进行正交试验，得出最佳提取工艺条件为酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，微波功率390 W，微波时间120 s，其中，微波功率对试验影响最大。抗氧化性试验结果表明，黄柏根色素在试验浓度范围对DPPH、羟基自由基的清除作用都呈量效关系，有较好的抗氧化能力，是一种天然有效的抗氧化剂。微波辅助纤维素酶提取黄柏根色素，以水作提取剂，具有操作简单、省时、节能、环保提取率高等多种优点。

参考文献：

［1］ 陈小利，吕俊芳，宁亚娣，等. 黄柏根中色素的提取与性质研究［J］．延安大学学报（自然科学版），2007，26（2）：57-59.

［2］ 安健，赵建平. 黄柏抗菌成分的提取及对真丝的抗菌性研究［J］．印染助剂，2008，25（6）：13-15.

［3］ 李永祥，詹少华，蔡永萍，等. 板栗壳色素的提取、纯化及稳定性［J］．农业工程学报，2008，24（9）：298-302.

［4］ 徐青海，明霞．天然色素的提取及其生理功能［J］．应用化工，2005，34（5）：268-270，273.

［5］ 何荣海，翟庆娇，仲晗实，等.微波辅助回流提取葵花籽粕绿原酸的研究［J］．中国粮油学报，2012，27（9）：107-111.

［6］ 魏凤玉，康家胜，张宇.纤维素酶法提取黄芪多糖的动力学［J］.过程工程学报，2012，12（5）：839-843.

［7］ 冯淑环，殷丽君，袁蕊，等. 酶法转化糖苷型沙棘叶黄酮生成苷元工艺优化［J］. 农业机械学报，2011，42（4）：127-132，138.

［8］ 吴峰华，罗志生，何志平，等. 山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究［J］.中国粮油学报，2011，26（8）：109-113，122.

［9］ 许平. 黄瓜多糖抗氧化活性研究［J］. 重庆工商大学学报（自然科学版），2009，26（1）：54-56．