剑麻总皂苷高产菌的筛选及发酵条件的优化

周菲菲+郝再彬+易克贤+郑金龙+王秀丽+

摘要：以绿色环保发酵生产提取剑麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）总皂苷为目标，采集土壤样品，对菌株进行初筛和复筛得到１株菌株，编号ＪＭＺ－Ｎ０６。通过料液比、发酵温度、发酵时间、发酵液初始ｐＨ四因素三水平的正交试验，确定了该菌的最适发酵条件为料液比１∶２０（g∶mL），发酵时间６０ ｈ，发酵温度３２ ℃，发酵液初始ｐＨ ６．０。

关键词： 剑麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）；正交试验；发酵条件；优化

中图分类号：Ｑ８１５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1863-05

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ Extracting Agave sisalana perr.ex Engelm Ｔｏｔａｌ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

ＺＨＯＵ Ｆｅｉ－ｆｅｉ１， ＨＡＯ Ｚａｉ－ｂｉｎ１， ＹＩ Ｋｅ－ｘｉａｎ２， ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ２， ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｌｉ１

（１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Bｉｏｌｏｇｉｃａｌ Eｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Cｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ

２．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌly ectract ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ， ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｎｏ． ＪＭＺ－Ｎ０６ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｗｉｃｅ ｓｃｒｅｅｎ ｆｒｏｍ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ and ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ including ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ｗａｓ １４２．５ ｍｇ／ｇ ｗｈｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ６０ ｈ ｕｎｄｅｒ ３２ ℃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶２０（g∶mL） ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ６．０.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Agave sisalana perr.ex Engelm； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

剑麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）又名凤尾兰，是生产硬质纤维的主要经济作物，由于剑麻叶片中纤维的含量仅占其本身的３％～５％，因此在剑麻纤维的加工过程中将产生大量的废弃物，如抽取纤维后产生的麻渣、麻汁，剑麻纤维加工过程中产生的麻糠、麻头等。这些废弃物中含有丰富的皂苷、果胶、叶绿素和纤维素，若将其直接排放或堆放，不仅导致大量资源的浪费，而且会对环境造成严重污染［１］。剑麻皂苷具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、止血、抗衰老、降血糖和保肝等多种活性［２－５］，被广泛应用于食品、保健品、药品等诸多领域。剑麻皂苷主要包括两部分即糖和苷元，分子结构如图１（Ｒ为糖），有５种单体结构Ｄｏｎｇｓａｐｏｎｉｎ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ［６－８］，平均相对分子质量为１ ２０９．８。

传统的皂苷分离提取方法主要有溶剂法、酸碱沉淀法、超声萃取法、超临界萃取法和生物工程发酵法。溶剂法局限性是提取分离有效组分的量以及纯化的程度都较低。酸碱沉淀法局限性是单相酸水解条件剧烈，常伴有脱水、构型变化等。超声萃取法能够避免高温高压对有效成分的破坏，但其对容器壁厚薄和容器的摆放位置有很高的要求。超临界萃取法对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，对 物料某些成分的提取具有更高的效率，但是皂苷类化合物的分子量大、羟基多、极性大，需要加大压力和加入适当的试剂来提高萃取产率。生物工程发酵法是通过加入菌株加速植物细胞壁的破除释放出有效成分［９］，从而降低提取难度，可减少原料、化工试剂，节约动力和劳力，减少环境污染［１０］。

１材料与方法

１．１材料与试剂

１．１．１菌种来源从广西桂林市周边山地采集到几百份土壤样品，从中筛选。

１．１．２主要试剂剑麻皂苷元标准品（９８％，ＨＰＬＣ纯，上海研生生物技术有限公司），剑麻残渣（广西剑麻集团），ＤＮＳ试剂：２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（２６２ ｍＬ）与３，５－二硝基水杨酸（６．３０ ｇ）混合加入５００ ｍＬ的热水溶液中（含１８２ ｇ的酒石酸钾钠），再加入苯酚５．００ ｇ及亚硫酸钠５．００ ｇ，待溶解完全，冷却至室温，用蒸馏水定容至１ Ｌ，贮存于棕色试剂瓶中，室温放置１０～１５ ｄ即可使用。

１．１．３培养基ＰＤＡ培养基：马铃薯２００．００ ｇ，葡萄糖２０．００ ｇ，琼脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；木聚糖培养基：马铃薯２００．００ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，琼脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；筛选平板培养基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，琼脂１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；摇瓶发酵培养基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ， ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ；种子培养基：ＮａＮＯ３ ２．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，葡萄糖３．００ ｇ，木聚糖２．００ ｇ，加水至１ Ｌ；产酶基础培养基：葡萄糖５．００ ｇ，蛋白胨６．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＣｌ ０．０５ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ。

１．１．４仪器Ｃａｒｙ５０型紫外可见光分光光度计（美国ＶＡＲＩＡＮ公司），ＳＨＺ－Ｄ（Ⅲ）型循环水式多用真空泵（巩义市子华仪器有限公司），手提式高压灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司），ＤＺＦ－６０５０型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），ＬＲＨ－１５０－Ｚ（Ⅱ）型微电脑控制振荡培养箱（广东省医疗器械厂）。

１．２试验方法

１．２．１菌种初筛无菌水浸泡剑麻麻渣２４ ｈ，纱布过滤，滤液备用。取土壤样品１０ ｇ，放入盛有１００ ｍＬ麻渣滤液三角瓶中。３０ ℃ １６０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养２４ ｈ，取该土壤稀释液５ ｍＬ离心，上清液涂布于筛选平板上，３０ ℃下恒温培养，挑选单菌落进一步复筛。

１．２．２菌种复筛将初筛的菌株在ＰＤＡ液体培养基中纯化，加入到种子培养基中，３０ ℃下培养３２ ｈ备用。

分别精密量取０．００、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０、１．４０、１．６０ ｍＬ葡萄糖标准溶液（母液浓度１ ｍｇ／ｍＬ），加入２５ ｍＬ具塞比色管中，编号 ０～８。加去离子水补足至２．００ ｍＬ，加入１．５０ ｍＬ ＤＮＳ 试剂，沸水中显色５ ｍｉｎ，冷却至室温后，加去离子水定容至２５ ｍＬ，充分混匀，在波长５４０ｎｍ处检测ＯＤ５４０ nm。以还原糖的含量ｘ（ｍｇ）对光密度Ｙ进行回归，得标准曲线方程为Ｙ＝０．１２８ｘ－０．０２０，ｒ＝０．９９９ 0，浓度范围１０～７０ μｇ／ｍＬ。

１．２．３ＤＮＳ 法测定菌体发酵还原糖的能力取备用菌液３０ ｍＬ离心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，收集菌体，加入到２％木聚糖的ＰＤＡ培养基中，恒温摇床培养４８ ｈ，离心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，取上清液，制备成还原糖提取液，ＤＮＳ法检测提取液中还原糖的含量。

１．２．４菌株生长曲线的绘制以１０％的接种量，将培养３ ｄ种子菌液接种到产酶发酵培养基中，２５ ℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养，间隔２ ｈ检测发酵液的ＯＤ５６０ nm，绘制发酵液中生物量、菌体与光密度的曲线。

１．２．５剑麻皂苷元标准曲线的制作制备皂苷元标准曲线：称量剑麻皂苷元标准品５．００ ｍｇ，用甲醇溶解并定容至５ ｍＬ，分别吸取０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ置２５ ｍＬ具塞试管中，以空白管作对照，在７０ ℃下烘干后冷却至室温。各管中依次加入５％香草醛冰醋酸０．２ ｍＬ，高氯酸０．８ ｍＬ，摇匀后置于７０ ℃烘箱中加热１５ ｍｉｎ，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入５ ｍＬ冰醋酸，摇匀，于４５０ ｎｍ处测定光密度值ＯＤ４５０ ｎｍ。以含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

１．３高产菌株发酵剑麻皂苷条件优化

选取料液比、发酵时间、发酵温度、发酵液酸碱度４个因素，通过麻渣中皂苷的提取率确定其适宜的发酵条件［１１－１４］。

１．３．１料液比对提取率的影响活化的种子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取沉淀备用。加入１００ ｍＬ无菌水稀释，制备８支稀释菌液，每４支一组。第一组灭活菌体１～４支作对照，两组试管分别加入５、１０、１５、２０ ｇ麻渣，标记号１～４和５～８。２８ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，取发酵液５ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取上清液，吸取１００ μＬ，对应标记１～８，真空干燥箱中烘干。其余同皂苷检测。

１．３．２发酵时间对提取率的影响种子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取沉淀备用。称取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ无菌水中，菌体加入麻渣料液中，１６０ ｒ／ｍｉｎ 恒温培养箱中培养，在１２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ时取发酵液离心，上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷检测。

１．３．３发酵温度对提取率的影响称取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ无菌水中，分别置于２４、２６、２８、３０、３２和３４ ℃下１６０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，将发酵液离心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷检测。

１．３．４发酵液初始ｐＨ对总皂苷提取率的影响称取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ无菌水中。３０ ｍＬ种子菌液４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，沉淀菌体加入麻渣料液中，调整发酵液ｐＨ依次为 ３、４、５、６、７和８，１６０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，将发酵液离心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷检测。

１．３．５正交试验设计根据以上单因素的试验结果，选取料液比（Ａ）、发酵时间（Ｂ）、发酵温度（Ｃ）、发酵液初始ｐＨ（Ｄ）为试验因素，按照正交试验设计Ｌ９（３４）进行试验，以剑麻总皂苷的提取量为考察指标，进行提取工艺的优选［１５］。因素与水平见表１。

１．３．６剑麻总皂苷提取工艺的稳定性按照正交试验选择的最优条件，重复皂苷的提取试验，评价试验结果［１６］。

２结果与分析

２．１ＪＭＺ－Ｎ０６菌株的筛选获得

由图２可知，该菌株平板培养时菌落表面光滑；光学显微镜下呈短棒形态；透射电镜下无鞭毛，长宽比２∶１。

２．２复筛

由表２可知，该菌株对木聚糖有较高的降解能力。因此该菌加速剑麻麻渣中木聚糖向单糖的降解，从而有利于麻渣中皂苷的释放，达到提高得率的目的。菌株有进一步研究的价值。

２．３菌株繁殖生长

细胞生长曲线是判定细胞活力的重要指标，也是细菌生物学特性的基本参数之一。一定波长下菌液的光密度表示菌量。由图３可知，培养３２ ｈ时，种子菌体吸光值达到对数生长期，此时发酵液中菌体活性最高，代谢活动最旺盛。

２．４剑麻皂苷元的标准曲线

测得剑麻皂苷元标准曲线方程为ｙ＝１．４１６ｘ＋０．０４２ ７，R2＝０．９９８ 0，在０．１～０．７ ｍｇ范围内具有良好的线性关系（图4）。根据剑麻皂苷的5种单体结构计算得出剑麻总皂苷的相对分子质量为１ ２０９．８，即得剑麻总皂苷的量Ｍ（ｍｇ）与光密度对应方程为Ｍ＝（ｙ－０．０４２ ７）×２．９０／１．４１６ ０。

２．５料液比对剑麻总皂苷提取率的影响

由表３可知，菌液接种量一定的情况下，１００ ｍＬ发酵液中加入的麻渣质量在１～５ ｇ时，皂苷的提取量随着麻渣质量的增加而明显增大，当麻渣加入量超过５ ｇ时，其麻渣中总皂苷的提取率随着麻渣质量的增加而逐渐减小。

２．６发酵时间对剑麻总皂苷提取率的影响

由表４可知，发酵１２～４８ ｈ时，皂苷的提取率随着发酵时间的延长而增大，之后略减小，可见在发酵４８ ｈ时总皂苷提取率最大。

２．７发酵温度对剑麻总皂苷提取率的影响

由表５可知，２４～３０ ℃时，随着温度的上升总皂苷提取率明显增加，之后提取率反而下降，温度越高剑麻总皂苷提取量越低。

２．８发酵液初始ｐＨ对剑麻总皂苷提取率的影响

由表６可知，初始ｐＨ为５．０时总皂苷的提取量达到最大值，当ｐＨ超过５．０时总皂苷提取率又迅速减少。

２．９正交试验结果

由表７中极差的直观分析法 Ｒ值可以看出，因素Ｂ的极差最大，说明发酵时间对总皂苷提取率的影响最大，其次是因素Ｄ和Ｃ，料液比对总皂苷提取率的影响最小。所以这４个因素对皂苷提取的影响由大到小的顺序依次为Ｂ、Ｄ、Ｃ、Ａ。由表７可知，剑麻总皂苷提取发酵最佳工艺条件为Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即料液比１∶２０（１ Ｌ发酵液中加入麻渣５０ ｇ），发酵时间６０ ｈ，发酵温度３２ ℃，发酵液初始ｐＨ ６．０。

４结论

本试验筛选１株ＪＭＺ－Ｎ０６，用于剑麻总皂苷的提取。以总皂苷提取量为指标，对发酵提取工艺进行了优选，最佳工艺条件为料液比１∶２０（g:mL），发酵时间４８ ｈ，发酵温度３２ ℃，发酵液初始ｐＨ ６．０。通过生物工程发酵法降解麻渣，降低了提取难度，使含有丰富皂苷资源的废弃物变废为宝可以实现规模生产。

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