一株烟草青枯病生防菌的筛选鉴定及其发酵优化

赵晓燕+杨欢+陈建刚+王昌军+冀志霞+陈守文+

摘要：以烟草青枯病原菌［茄科雷尔氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）］为筛选指示菌，采用平板共培养初筛和发酵上清滤液复筛的方法，筛选到烟草青枯病拮抗菌株ＸＬＡ０３，其抑菌圈直径为１３．７４ ｍｍ；经１６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定，菌株ＸＬＡ０３为解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。由单因素试验和正交试验优化得到了菌株ＸＬＡ０３生物量较高的摇瓶发酵培养基配方为玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１0 ｇ／Ｌ ；培养条件为起始ｐＨ ７．０，接种量１％，装液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。

关键词： 烟草青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；筛选；发酵优化

中图分类号：S435.72；TQ458文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1810－０5

Screening and Fermentation Optimization of Antagonistic Bacillus against Tobacco Bacterial Wilt

ZHAO Xiao-yan1,YANG Huan2, CHEN Jian-gang1,WANG Chang-jun3, JI Zhi-xia1, CHEN Shou-wen1

(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070, China;2. Wuhan Leyang Biotechnology Co., Ltd.， Wuhan 430071, China;3. Hubei Tobacco Research Institute, Wuhan 430030, China)

Abstract: One bacterial strain was screened ｆｏｒ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ ｎａｍｅｄ ａｓ ＸＬＡ０３． Ｉｔｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １３ ｍｍ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＸＬＡ０３ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｏｍａｓｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌａｓｋｓ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈ １５．０ ｇ／Ｌ， ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ５０．０ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ７．０， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｏｆ １％ ｌｏａｄｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

烟草青枯病［病原物为茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）］是一种典型的维管束病害，最显著的发病症状是烟草植株出现枯萎现象，危害期大多出现在烟草旺长期或者旺长期以后，根、茎、叶部均会受害［1，2］。经常发病产烟区的老病田或旱地烟田几乎每年都会发生，形成绝产无收和全田发病的现象，造成大面积烟草产量、品质下降，制约着烟草产业的发展［3］。目前防治烟草青枯病的方法主要包括化学防治、生物防治、加强栽培管理和选用优质的抗病品种［4-7］，但这些方法均无法杜绝该病的发生。生产过程中一般以种植抗性烟草品种和轮作为基础，同时加强大田栽培管理，通过化学药物辅助保护的综合防治技术控制病害发生。由于消费者对烟草品质的要求逐步提高，对烟草成熟期病害的防治不宜采用有残留的化学药剂，而使用拮抗细菌防治植物病害能达到无公害防治的目的［8，9］。

国内外关于拮抗细菌防治植物青枯病的报道涉及的生防细菌主要有芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等。其中芽孢杆菌是一类好氧和兼性厌氧微生物，所产芽孢抗逆能力强、繁殖速度快、营养要求简单，易在植物表面定殖。由于其芽孢生命力强，有利于生防制剂的生产和储存［10］。国内学者相继发现一些芽孢杆菌对烟草青枯病菌具有拮抗作用，尹华群等［11］从烟草健株中分离得到对烟草青枯菌有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌菌株001、短芽孢杆菌菌株009 和011；彭细桥等［12］从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的烟草健株上分离筛选出有强拮抗作用的枯草芽孢杆菌H-1、短芽孢杆菌H-9和H-11。关于烟草青枯病的拮抗芽孢杆菌的研究主要集中在拮抗机制、通过优化培养条件提高其抑菌活性［13］方面，鲜见关于通过优化拮抗菌株的发酵培养条件提高其生物量的报道。

在农业生产应用中，芽孢菌剂具有易储藏、复活性高的优点。在芽孢杆菌发酵过程中，芽孢产生的情况受营养和培养环境影响较大，不同菌株的芽孢产生的条件也不同。本研究对影响生防菌XLA03生长的培养基的成分和培养条件进行了筛选和优化，为获得高浓度、高活性的芽孢用于制备生防菌制剂防治烟草青枯病奠定基础。

1材料与方法

1.1 供试材料

烟草青枯病菌为温室烟株叶片强致病力菌株；烟草及烟草根际土壤从湖北省恩施州咸丰县、恩施市盛家坝和下云坝等种植区域随机取点采样获得。NA培养基、NB培养基、蛋白培养基、纤维素培养基、几丁质培养基、PDA培养基参照文献［14］的方法配制。

1.2烟草青枯病拮抗菌的分离和筛选

烟草叶、茎、根经常规表面消毒后，选择表面无病的样品在研钵中研磨，将组织液涂布于NA平板上。同时将少量烟株根际土壤加入有玻璃珠的无菌生理盐水中，振荡摇匀后稀释涂布于NA平板上进行分离纯化，将分离纯化获得的菌株进行编号。

采用平板共培养筛选［15］和发酵液上清滤液复筛。用烟草青枯病菌作指示菌初步测定拮抗能力，28～30 ℃正置培养2～3 d后观察抑菌圈，根据抑菌圈的有无和大小判断拮抗能力强弱。复筛时含菌培养基平板吹干后用打孔器打孔，试验菌菌液通过无机滤膜过滤，取50 μL滤液注入孔中，28～30 ℃正置培养2～3 d后观察抑菌圈。

1.3菌株的形态观察及部分生理生化指标测定

以实验室保存的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）P1（11079）菌株为参照，菌株XLA03的生理生化鉴定参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《伯杰细菌鉴定手册》。

1.416S rDNA序列相似性分析

提取试验菌株XLA03的16S rDNA进行基因扩增［16］。纯化后的产物测序由北京奥科生物技术有限责任公司利用ABI3730XL自动测序仪完成。菌株XLA03的16S rDNA基因测序结果用NCBI的Blast软件进行序列相似性分析。从GenBank数据库和核糖体数据库中选取相近种属的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通过Clustal 1.8 和MEGA 4.0软件进行系统发育分析，构建基于16S rDNA基因序列的系统发育树。

1.5培养基成分的优化

1.5.1单因素优化 分别将出发培养基（NB培养基）中的碳源（葡萄糖）依次替换为玉米淀粉、蔗糖、 乳糖、麦芽糖； 氮源（牛肉膏）依次替换为玉米浆、大豆饼粉、豆粕、酵母粉； 无机盐（氯化钠）依次替换为硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰。通过拮抗菌的生物量来确定最佳碳源、 氮源和无机盐。

确定最佳碳源、 氮源和无机盐后，根据拮抗菌的生物量进一步优化培养基，最终确定最佳碳源、氮源和无机盐的浓度范围。

1.5.2正交优化试验培养基成分的正交优化试验是根据单因素的优化结果，选择玉米淀粉、豆粕、 磷酸氢二钾、硫酸锰作为培养基的碳源、氮源和无机盐，每个因素选3个最佳的用量水平，采用正交表进行正交试验，根据生物量的情况确定最佳的培养基配方。

培养条件的正交优化试验的因素设计以前期研究为依据。选择起始pH、装液量、接种量为因素，每个因素选3个不同水平，进行正交试验，根据生物量的大小确定优化的培养条件。

2结果与分析

2.1烟草青枯病拮抗菌的分离和筛选

从恩施4个烟草种植区域共采集样品48份，分离得到192株细菌，初筛得到拮抗菌24株，复筛发现其中4株拮抗作用明显，抑菌圈达到10 mm以上，具体情况见表1。其中下云坝健康烟草叶片中分离的菌株XAL03的抑菌圈最大，直径达到13.74 mm，确定菌株XAL03对青枯病菌拮抗作用最强，将其作为试验菌进行后续试验。

2.2拮抗菌株XAL03的生理生化检测

拮抗菌XAL03在LB平板上培养24 h，形成的单菌落类似圆形，边缘不规则，有隆起，表面皱褶，不透明，干燥，菌落近白色。菌株XAL03的形态、生理生化特征（表2）与Bacillus amyloliquefaciens P1接近。

2.3系统发育分析

提取拮抗菌株XAL03的16S rDNA进行基因测序，将核酸序列提交到NCBI的GenBank数据库进行同源性比对（Blastn）。结果显示，菌株XAL03的序列和Bacillus amyloliquefaciens（AB255629）的序列相似性达到99.73%。选取同源性97%以上相近种属菌株的16S rDNA基因序列进行比对，构建系统发育树，结果见图1。菌株XAL03同解淀粉芽孢杆菌属于同一个聚类。

2.4菌株XLA03的培养基优化

2.4.1单因素优化 以NB培养基为基础培养基 （CK）， 对碳源、氮源、无机盐进行单因素等量替代，通过发酵培养测定XAL03的生物量。在相同条件下培养48 h后进行比较，不同碳源和氮源条件下XAL03生长情况也就不一样（表3）。XAL03生物量由大到小所对应的碳源分别为玉米淀粉 、麦芽糖、乳糖 、蔗糖、CK，生物量由大到小所对应的氮源分别为豆粕、玉米浆 、大豆饼粉、 酵母粉 、CK。以玉米淀粉为碳源时，其培养液的OD600 nm达到3.57，以豆粕为氮源时OD600 nm达到11.57，因此，确定生物量达到最大的玉米淀粉和豆粕分别作为后续试验的碳源和氮源。对最佳碳源、氮源分别设置不同用量进行XAL03发酵培养，比较生物量大小。结果（表4）表明，玉米淀粉用量40 g/L、豆粕用量20 g/L时发酵液中XAL03的生物量达到最大。

设置不同磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰含量的培养基，发酵培养48 h后分别测定XAL03的生物量。结果（表5）表明，磷酸氢二钾用量1.5 g/L、硫酸镁用量0.75 g/L、硫酸锰用量0.010 g/L时，菌体的生物量达到最大值。

2.4.2培养基配方和培养条件正交试验优化为了进一步对发酵培养基配方进行优化，采用Minitab 15.0软件设计培养基配方的4因素3水平正交试验（表6），考察培养基配比对生物量的影响。结果见表7。

由表7可见，各因素影响XAL03生物量的主次顺序为B、D、A、C，最优组合为A3B3C2D1。结合“2.4.1”的试验结果，最终得到优化的培养基各成分用量为玉米淀粉 15.0 g/L、豆粕50.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、MnSO4·H2O 0.010 g/L。

培养条件的优化选择起始pH、接种量和装液量（250 mL三角瓶）进行正交试验（表8），结果见表9。由表9可知，各因素影响XAL03生物量的主次顺序为B、C、A，最优组合为A1B2C1。由正交试验结果得到优化的培养条件为起始pH 7.0、接种量5%、装液量20 mL/250 mL。在优化的发酵培养基和发酵条件下，解淀粉芽孢杆菌XAL03生物量最高，为150.50×108 CFU/mL。

3小结与讨论

用烟草青枯病菌作初步拮抗测定，根据抑菌圈筛选出拮抗能力较强的菌株XAL03，对其生理生化指标和16S rDNA序列进行分析，初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

生防菌制剂的规模生产往往需要考虑成本因素。对于培养基的选择应该遵循原料来源丰富、价格低廉的原则。通过单因素试验和正交试验相结合，得到了生物量较高的培养基配方为玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１０ ｇ／Ｌ；优化得到发酵条件为接种量５％、初始ｐＨ ７．０、装液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，ＸＡＬ０３的生物量为１５０.50×１０8 ＣＦＵ／ｍＬ。后续研究得到最优发酵条件为接种量１％、初始ｐＨ ７．０、装液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ， 在此条件下，芽孢形成达９４％以上，生物量比出发培养基提高了６．０倍，达到１．０７×１０１０ ＣＦＵ／ｍＬ。

拮抗微生物能够在叶围及根际生存、定殖，在植物体表占据有利的空间，与病原物进行空间及营养的竞争，同时还能分泌拮抗物质，如几丁质酶、抗生素、细菌毒素等，这些物质能抑制甚至杀死病原菌［１７，１８］，菌株ＸＡＬ０３的生防机理还有待进一步研究。本研究筛选出解淀粉芽孢杆菌ＸＡＬ０３在烟草青枯病的防治中存在潜在的重大应用价值，优化后的培养基配方对其生物菌剂的生产具有重要意义。

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