黄连碱对软骨细胞增殖及转化生长因子β1mRNA基因的表达的影响

陈建武 王晓娟

·论著·

黄连碱对软骨细胞增殖及转化生长因子β1mRNA基因的表达的影响

陈建武 王晓娟

目的观察黄连碱对Sprague Dawley大鼠关节软骨细胞体外增殖及转化生长因子β1mRNA基因表达的影响，探讨其治疗骨关节炎的作用及可能机制。方法取SD大鼠关节软骨，剪碎后，采用酶消化法原代分离培养软骨细胞，取处于对数生长期第3代细胞随机分组，实验组加入含10 μm黄连碱的培养基，对照组仅加入普通培养基。培养48小时后在倒置显微镜下观察软骨细胞形态，MTT法检测黄连碱在1，3，5，7天对软骨细胞增殖影响，实时荧光定量PCR分别检测培养7天后实验组和对照组细胞转化生长因子β1mRNA表达。结果培养48小时后实验组软骨细胞生长密集程度明显优于对照组；MTT检测也显示实验组细胞增殖情况优于对照组；培养7天后实验组转化生长因子β1mRNA表达显著高于对照组。结论黄连碱能促大鼠软骨细胞增殖，并提高转化生长因子β1mRNA的表达，提示这可能是其治疗骨关节炎的可能机制之一。

黄连碱； 软骨细胞； 增殖； 转化生长因子β1

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是临床最常见的关节疾病之一，其最主要的病理性改变是进行性关节软骨退变，从而导致周围骨质和关节滑膜发生病理改变，骨性关节炎发展到终末期会导致关节畸形而丧失功能[1]。关节软骨细胞的过度凋亡是骨性关节炎发生发展的重要原因。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞成分，各种细胞因子调节着软骨细胞的增殖、分化及代谢，并始终贯穿于关节软骨修复的过程中，目前国外研究已经证实转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1， TGF-β1)在软骨细胞修复中起着重要的作用[2]。中药黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch的干燥根茎，中医认为长期应用具有清热、燥湿、解毒、泻火的功效。现代医学研究表明，黄连具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病等作用，黄连碱是黄连主要活性成分之一[3]。目前关于黄连碱对软骨细胞增殖影响的研究报道较少。本研究采用体外软骨细胞共培养的方法，观察黄连碱对大鼠关节软骨细胞的增殖及转化生长因子β1的表达情况，初步探讨其治疗骨关节炎的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

本研究采用的清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠购置于兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物中心；DMEM培养基(赛业生物科技有限公司，广州，中国)；0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型胶原酶、青链霉素混合液(Gibco，美国)；胎牛血清(FBS)(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；黄连碱(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST10030711)；PBS(索莱宝生物科技有限公司)；TGF-β1及GAPDH引物均购自上海生物工程有限公司；TRIzol(Invitogen公司，加利福尼亚，美国)；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO Life Science，东京，日本)；SYBR Green Realtime PCR master Mix-Plus(TOYOBO Life Science，东京，日本)。

1.2 仪器与设备

恒温恒湿二氧化碳培养箱(型号 DH-801 上海三腾仪器有限公司，上海，中国)；酶联免疫检测仪(型号 RJ17DG5033A 中西集团，辽宁沈阳，中国)；紫外分光光度计(Beckman DU530 Germany)；实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems Company, Carlsbad, USA)；洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置显微镜(Olympus公司，东京，日本)。

1.3 大鼠膝关节软骨细胞的分离和培养

脱颈处死SD大鼠后，碘酊、75%乙醇消毒、铺巾，正中切口切开膝关节，用无菌刀片切取股骨髁、滑车及髌骨表面的关节软骨并置于含双抗的PBS缓冲液无菌培养皿中，加盖移入超净工作台，首先用含有双抗的PBS缓冲液反复漂洗组织3次，采用无菌手术器械去除黏附于软骨周围的血液及组织。将冲洗清理干净的软骨用眼科剪剪碎并置入无菌瓶中，依次加入0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型酶，在磁力搅拌条件下消化，待无明显的软骨组织块时终止消化，取消化液置于离心管于1500 r/min离心8分钟，弃上清，加入含10%胎牛血清DMEM培养基4 ml重悬细胞，接种到25 cm2培养瓶中，静置于恒温37℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养，每隔三天更换1次培养液，按时在倒置显微镜下观察、拍照，当细胞增殖至瓶底80%左右时按适当比例传代培养。

1.4 分组

实验组为10 μm黄连碱与P3代大鼠软骨细胞共培养；对照组为P3代大鼠软骨细胞普通培养基培养。

1.5 观察指标及实验步骤

1.5.1 镜下观察软骨细胞生长情况及细胞形态 实验组为含黄连碱(10 μm)的10%胎牛血清DMEM培养液与大鼠关节软骨细胞(P3代)5×104在六孔板中共培养，对照组将大鼠关节软骨细胞5×104在含10%胎牛血清DMEM培养液的六孔板中培养。在37℃饱和湿度及5%二氧化碳细胞孵育箱中分别进行共培养和单独培养48小时后观察细胞生长情况。

1.5.2 MTT检测 取形态良好并处于对数生长期的3代软骨细胞，常规采用胰酶消化离心后，用含10%胎小牛血清的DMEM培养液将消化后获得的细胞稀释并计数成2.5×106/L后，接种于96孔板中每孔200 μl，培养条件与既往培养条件一致。分别在第1、3、5、7天时，实验组和对照组每个时间点各取5个孔，每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS 配)20 μl。孵育4小时后终止培养，吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞离心后再吸弃培养上清液。分别在孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10分钟，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，检测波长设定为490 nm并记录结果[4]。

1.5.3 软骨细胞TGF-β1 mRNA检测 将培养7天后的细胞用胰酶消化后离心收集。移入匀浆器中并加入1 ml Trizol，充分研磨后静置15分钟，经氯仿萃取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤后加入30 μl DEPC 水溶解提取总RNA，用分光光度仪检测RNA纯度及浓度。反转录及扩增过程均按试剂盒说明书步骤进行。反应条件为95℃预变性60秒，采用三步法测定：95℃ 15秒，57℃30秒，72℃ 45秒共计进行40个循环。TGF-β1引物: 上游引物序列为5’-TTC TCC ACC AAC TAC TGC TTC-3’，下游引物序列为5’-GGT GTC CAG GCT CCA GAT-3’。采用GAPDH作为内参照，根据荧光定量PCR仪显示的CT值结果，以对照组做参照通过2-ΔΔCt方法计算RQ值并统计分析两组的相对基因表达差异。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 体外培养软骨细胞

实验组和对照组细胞在相同培养条件下培养48小时后，倒置显微镜100倍显微视野下观察，两组培养细胞均未发现污染及支原体感染迹象，黄连碱共培养组软骨细胞密集程度明显高于对照组且形态良好，见图1。

图1 体外培养48小时后软骨细胞形态

2.2 MTT测定结果

两组细胞在体外培养对数生长期第1、3、5、7天均呈明显上升趋势，细胞生长第1天两组无统计学差异，实验组于第3、5、7天均高于对照组，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。说明与一定浓度的黄连碱共培养液能够促进大鼠关节软骨细胞促增殖,见表1。

表1 软骨细胞体外培养MTT检测结果

注：同一时间点实验组与对照组相比aP<0.05

2.3 qRT-PCR结果

提取RNA并稀释100倍后用分光光度仪检测吸收波长在A260及A280的OD值，求得各样本的A260/A280比值在1.8～2.0之间，说明提取的RNA纯度较高。据A260的OD值计算得RNA浓度。按照试剂盒说明书进行反转录及扩增后行荧光定量，获得CT值，计算RQ值。结果实验组TGF-β1 mRNA的表达显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 软骨细胞TGF-β1 mRNA表达qRT-PCR检测结果

3 讨论

依据膝关节骨性关节炎的临床表现等疾病特点，中医将其归入“痹证”范畴。《诸病源候论·风痹证》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹，其状肌肉顽厚或疼痛。”《黄帝内经》对痹症也进行了详细的阐述，认为风、寒、湿邪气侵袭机体、经络、脏腑，闭阻不散，从而导致关节疼痛、肿胀、僵直。可见风寒湿邪在痹证发生发展过程中的起着至关重要的作用。大量临床报道采用中医药方法治疗本病亦多从祛风湿、止痹痛着手，且取得一定的疗效。而临床常用的痹证验方干预骨关节炎软骨细胞的基础实验从多方面证实祛风湿、止痹痛治法的有效性[5]。黄连碱是属于异喹啉生物碱，这类生物碱主要包括小檗碱、黄藤素、表小檗碱和木兰碱等[6]。这类生物碱具有多种生物学活性，如抗糖尿病、抗炎和抗氧化的作用[7-9]。目前多数研究都关注于小檗碱的抑制骨吸收作用[10]。药代动力学研究发现口服黄连碱也具有其生物学活性[11-12]。日本学者研究发现黄连碱能够有效抑制RANKL介导的NFATc1基因的表达，从而抑制破骨细胞的增殖和其骨吸收的活性[13]。回顾文献发现与小檗碱和黄藤素相比，对黄连碱的研究相对较少，因此在本研究中研究了黄连碱对软骨细胞的影响。

TGF-β1是一类具有多种功能的细胞因子，广泛存在在动物的正常组织细胞内，其中以骨组织中和血小板中的含量最显著。目前研究发现TGF-β1是目前多种调节软骨细胞增殖分化相关因子中作用最强的，在关节软骨的生长和修复中起了关键的作用。一方面，TGF-β1具有向软骨分化的诱导作用，其可以诱导骨髓间充质干细胞像软骨细胞分化。另一方面，TGF-β1具有促进软骨细胞增殖分化和分泌细胞外基质的作用。其可以促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖，这两种细胞外基质是构成关节软骨的主要成分。本研究发现，采用含有黄连碱的培养液体外培养软骨细胞能够显著的增加软骨细胞TGF-β1的表达，从而增加软骨细胞外基质的分泌。然而这种促进软骨细胞TGF-β1表达的机制是否存在剂量依赖和时间依赖关系还需要在进一步的研究中证实。除此以外，还有相关研究证实，TGF-β1的表达增加能够显著抑制人软骨细胞金属蛋白酶1mRNA基因的表达，刺激人软骨细胞金属蛋白酶1组织抑制剂mRNA基因表达，金属蛋白酶1表达的增高与人骨关节炎的形成具有密切关系。另外有研究发现TGF-β1可以显著抑制软骨细胞凋亡，其机制是通过TGF-β1信号传导时细胞膜上的TGF-β受体Ⅰ和TGF-β受体Ⅱ共同参与，并通过受体下游信号分子Smad家族实现的，Smad家族中Smad2和Smad3可抑制软骨细胞的成熟过程，实际上亦即TGF-β1可以阻止软骨细胞向成熟方向分化，进而阻止其凋亡发生。

本研究发现，黄连碱能够在体外有效维持关节细胞的形态并且促进软骨细胞的增殖，能够显著提高关节软骨细胞的TGF-β1的表达。这可能是其治疗骨关节炎的可能机制之一。然而，黄连碱是通过何种机制促进软骨细胞增殖分化和TGF-β1的表达还需要进一步的研究。

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(本文编辑：秦楠)

EffectofcoptisineonproliferationofratarticularchondrocytesculturedinvitroandmRNAexpressionoftransforminggrowthfactor-beta1

CHENJian-wu,WANGXiao-juan.

MedicalDivisionofXinjiangmilitaryregion,Urumqi830042,China

Correspongdingauthor:WANGXiao-juan,E-mail：wangxiaojuan491@126.com

ObjectiveTo observe the effect of coptisine on the proliferation of rat articularchondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and then to explore the role and possible mechanism of coptisine in the treatment of osteoarthritis.MethodsKnee cartilage was shredded after harvested from SD rats under sterile conditions, and chondrocytes were isolated and cultured by the way of enzymatic digestion. After identifying by toluidine blue staining, the third-passage cells in the logarithmic growth phase were cultured in vitro and randomly divided into two groups after adherence. The experimental groups were cultured in DMEM with 10 μm coptisine, while the control group was given with normal medium alone. Chondrocytes morphology was observed under an microscope after 48 hours. 1, 3, 5, 7 days later, Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) assay method was adopted to observe the influence of coptisine on the proliferation of chondrocytes.Transforming growth factor-β1 mRNA levels were detected and analysed by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR) at 7days after cell culture.ResultsThe cell growth intensity in the co-culture group was significantly better than in the control group observed under microscopeafter 48 hours after culture. MTT assay showed that cell proliferation in experimental group were higher than in the control group after 3 days of cell culture.transforming growth factor-β1 mRNA level in the co-culture group weresignificantly better than the control group after 7 days of cell culture.Conclusioncoptisine can promote proliferation of chondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and these may be one of the possible mechanisms thatcoptisine can work in the treatment of osteoarthritis.

Coptisine； Chondrocyte； Proliferation； Transforming growth factor-β1

830042 乌鲁木齐，新疆军区联勤部卫生处(陈建武)；解放军第23医院药械科(王晓娟)

陈建武(1974- )，本科，主治医师。研究方向：卫生事业管理。E-mail: chenjianwu491@126.com

王晓娟(1972- )，女，本科，主管药师。研究方向：药理研究及临床应用。E-mail: wangxiaojuan491@126.com

R285.6

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.04.004

2014-01-18)