高效液相色谱法测定丁桂儿脐贴中桂皮醛和胡椒碱含量

杨晓宁 禹玉洪 刘辉 董蓉 张超

·论著·

高效液相色谱法测定丁桂儿脐贴中桂皮醛和胡椒碱含量

杨晓宁 禹玉洪 刘辉 董蓉 张超

目的建立丁桂儿脐贴中桂皮醛和胡椒碱的含量测定方法。方法采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 um)，测定桂皮醛以甲醇—水(50∶50)为流动相，检测波长为290 nm；测定胡椒碱以乙腈—水(45∶55)为流动相，检测波长为343 nm。结果桂皮醛进样量在0.1053～3.3696 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)，胡椒碱进样量在0.02592～0.25920 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)，它们准确度、精密度、稳定性均符合要求。结论采用高效液相色谱(HPLC)法测定丁桂儿脐贴中丁香酚和胡椒碱含量，具有简便、快速、准确等优点，可用于控制丁桂儿脐贴的质量。

丁桂儿脐贴； 高效液相色谱； 桂皮醛； 胡椒碱； 含量测定

丁桂儿脐贴(小儿腹泻帖)是针对儿童常见病，高发病腹泻腹痛的预防和治疗用药，由丁香、肉桂、荜茇组成，临床疗效好，安全无副作用。为了提高其质量控制标准，笔者采用高效液相色谱法测定丁桂儿脐贴中有效成分桂皮醛和胡椒碱含量。

1 仪器与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪；AB265-S电子天平(Mettler Toledo)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。桂皮醛对照品(购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：110710-201016)，胡椒碱对照品(购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：0775-200203)；乙腈及甲醇为色谱纯(Burdick&Jackson公司)，超纯水，无水乙醇为分析纯。丁桂儿脐贴来源于亚宝药业集团股份有限公司，批号110849、110850、110851，随机抽取连续生产的3批成品。

2 方法与结果

2.1 桂皮醛含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 以Agilent technologies ZORBAX SB-C18为色谱柱；以水—甲醇(50∶50)为流动相；检测波长为290 nm。理论板数按桂皮醛峰计算应不低于3000[1]127-128。

2.1.2 溶液的制备 (1)对照品溶液的制备：取桂皮醛对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中加无水乙醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。(2)供试品溶液的制备：取装量差异项下本品10贴，除去盖衬、背衬，剪碎，混匀，立即取样约0.5 g，精密称定，置具塞棕色锥形瓶中，精密加入无水乙醇50 ml，称定重量，置冷水浴中，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30分钟，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液置冰箱中冷藏，放置过夜，滤过，取续滤液，即得。(3)肉桂阴性对照溶液的制备：按处方药味比例，去肉桂，按制备工艺制成阴性对照制剂，再按供试品溶液制备方法制备成阴性对照液。

2.1.3 准确度 精密称取装量差异项下同一批本品9份，每份约0.25 g，分成3组，分别精确加入0.9477 mg/ml的桂皮醛对照品溶液0.8 ml、1 ml、1.2 ml(即含桂皮醛0.7582 mg、0.9477 mg、1.1372 mg)，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，测定含量。色谱条件同“2.1.1”的方法。桂皮醛的平均回收率为102.47%，RSD=0.52%，n=9。表明该法加样回收率合格。

2.1.4 精密度 (1)重复性：实验室的实验人员(A)操作，精密称取装量差异项下同一批本品6份，每份约0.5 g，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，色谱条件同“2.1.1”项下的方法。测定桂皮醛的平均含量为3.82 mg/g，RSD=1.60%，n=6。表明样品重复性良好。(2)中间精密度试验：同实验室不同实验人员(B)操作，精密称取装量差异项下同一批本品6份，每份约0.5 g，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，使用不同的色谱柱(Agilent technologies Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，色谱柱S/N：USH016008)、不同的液相测定，色谱条件同“2.1.1”项下的方法，并与实验人员(A)测定结果相比较，结果测定桂皮醛的平均含量为3.80 mg/g，RSD=1.22%，n=12。表明样品中间精密度良好。

2.1.5 专属性 (1)分别精密吸取肉桂阴性对照溶液、空白溶剂(无水乙醇)及流动相各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(2)结果：在肉桂阴性对照溶液、空白溶剂(无水乙醇)及流动相色谱图中，在与桂皮醛对照品色谱峰相应的保留时间(RT=12.9～13.3分钟)点，未见有色谱峰。(3)结论：阴性无干扰，本品其他药材、溶剂及辅料不干扰本品的桂皮醛含量测定。本方法的专属性很好，见图1。

A：桂皮醛对照品；B：供试品溶液；C：肉桂阴性对照溶液；D：流动相；E：空白溶剂图1 桂皮醛含量测定专属性HPLC色谱图

2.1.6 线性 (1)对照品溶液的制备：精密称取桂皮醛对照品适量，加无水乙醇制成每1 ml含1.053 mg的溶液，即得对照品储备液。(2)精密量取上述对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6 ml、3.2 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品1、2、3、4、5、6。分别精密量取10 μl，注入色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标作图。计算得到线性回归方程为Y=10705X+96.038(r=0.9999)，结果表明桂皮醛0.1053～3.3696 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 供试品溶液的稳定性考察 取装量差异项下本品10贴，除去盖衬，剪碎，混匀，取约0.5 g，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，分别在制备后0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时进样。在24小时内测得桂皮醛平均峰面积为3957.92，RSD=0.47%，表明样品在24小时内稳定性良好。

2.1.8 样品的桂皮醛含量测定 分别测定本公司三批丁桂儿脐贴成品，按照“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，色谱条件同“2.1.1”项下的方法，测定桂皮醛含量，结果见表1。

表1 三批样品桂皮醛含量测定结果(n=4)

2.2 胡椒碱含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验 以Waters X Bridge C18为色谱柱；以乙腈—水(45∶55)为流动相；检测波长为343 nm。理论板数按胡椒碱峰计算应不低于3000[1]219。

2.2.2 溶液的制备 (1)对照品溶液的制备：取胡椒碱对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中加无水乙醇制成每1 ml含12 μg的溶液，即得。(2)供试品溶液的制备：取装量差异项下本品10贴，除去盖衬、背衬，剪碎，混匀，取约0.5 g，精密称定，置100 ml棕色量瓶中，加入无水乙醇90 ml，密塞，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30分钟，放至室温，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，置冰箱中冷藏，放置过夜，滤过，取续滤液，即得。(3)荜茇阴性对照溶液的制备：按处方药味比例，去荜茇，按制备工艺制成阴性对照制剂，再按供试品溶液制备方法制备成阴性对照液。

2.2.3 准确度 精密称取装量差异项下同一批本品9份，每份约0.25 g，分成3组，分别精确加入0.5702 mg/ml的胡椒碱对照品溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml(即含胡椒碱0.4562 mg、0.5702 mg、0.6843 mg)，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，测定含量。色谱条件同“2.2.1”项下的方法。胡椒碱的平均回收率为100.46%，RSD=1.43%，n=9。表明该法加样回收率合格。

2.2.4 精密度 (1)重复性：由实验室的实验人员(A)操作，精密称取装量差异项下同一批本品6份，每份约0.5 g，按“2.2.1”项下方法配制供试品溶液，测定含量。色谱条件同“2.2.1”项下的方法。测定胡椒碱的平均含量为2.15 mg/g，RSD=0.71%，n=6。表明样品重复性良好。(2)中间精密度：由同实验室不同实验人员(B)操作，精密称取装量差异项下同一批本品6份，每份约0.5 g，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，使用不同的色谱柱(Agilent，SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，色谱柱S/N：USCL032313)、不同的液相(Agilent 1200高效液相色谱仪，编号：4号)测定，色谱条件同“2.2.1”项下的方法，并与实验人员(A)测定结果相比较。结果测定胡椒碱的平均含量为2.15 mg/g，RSD=0.26%，n=12。表明样品中间精密度良好。

2.2.5 专属性 (1)分别精密吸取荜茇阴性对照溶液、空白溶剂(无水乙醇)及流动相各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(2)结果：在荜茇阴性对照溶液、空白溶剂(无水乙醇)及流动相色谱图中，在与荜茇对照品色谱峰相应的保留时间(RT=13.5～13.9分钟)点，未见有色谱峰。(3)结论：阴性无干扰，本品其他药材、溶剂及辅料不干扰本品的胡椒碱含量测定，本方法的专属性很好，见图2。

A：胡椒碱对照品；B：供试品溶液；C：荜茇阴性对照溶液；D：流动相；E：空白溶剂图2 胡椒碱含量测定专属性HPLC色谱图

2.2.6 线性 (1)对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品适量，加无水乙醇制成每1 ml含0.864 mg的溶液，即得对照品储备液。精密量取上述对照品溶液3 ml至100 ml量瓶，无水乙醇定容，摇匀，即得对照品浓度为0.02592 mg/ml的对照品储备液。(2)精密量取浓度为0.02592 mg/ml的对照品储备液1.0 ml、3.0 ml、5.0 ml、7.0 ml、9.0 ml、10.0 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品1、2、3、4、5、6。分别精密量取10 μl，注入色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标作图。计算得到线性回归方程为Y=66613X-3.8247(r=0.9999)，结果表明胡椒碱0.02592～0.25920 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 供试品溶液的稳定性考察 本次试验考察了供试品溶液的稳定性，方法如下：取装量差异项下下本品10贴，除去盖衬，剪碎，混匀，取约0.5 g，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，分别在制备后0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时进样。在24小时内测得胡椒碱平均峰面积为820.9，RSD=0.44%。表明样品在24小时内稳定性良好。

2.2.8 样品的胡椒碱含量测定分别测定 本厂三批丁桂儿脐贴成品，按照“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，测定胡椒碱含量，结果见表2。

表2 三批样品胡椒碱含量测定(n=4)

3 讨论

桂皮醛含量测定流动相考察了乙腈—水[1]127-128、甲醇—水系统，结果乙腈—水系统为流动相桂皮醛峰拖尾，而甲醇—水系统为流动相桂皮醛峰拖尾因子符合规定，最后根据保留时间、拖尾因子、分离度等因素，确定流动相选择甲醇—水(50∶50)。胡椒碱含量测定流动相选择参照2010版《中华人民共和国药典》一部荜茇[1]219含量测定项下流动相甲醇—水系统，并考察了乙腈—水系统[2]。由试验结果可知流动相乙腈—水(45∶55)，保留时间合适，分离度大于1.5，拖尾因子略超出0.95～1.05，理论板数大于3000，胡椒碱峰能够得到很好的分离，且峰型较好，故流动相选择乙腈—水(45∶55)。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京：化学工业出版社，2010：127-128，219.

[2] 邰台川，彭霞. RP-HPLC法测定傣药辣藤中胡椒碱的含量[J]. 中国民族医药杂志，2008，14(2)：50-52.

(本文编辑：董历华)

DeterminationofcinnamaldehydeandpiperineinDingguierUmbilicalPastebyHPLC

YANGXiao-ning,YUYu-hong,LIUHui,etal.

YaobaoPharmaceuticalgroup,Beijing101111,China

YANGXiao-ning,E-mail：yn3528@126.com

ObjectiveTo establish a method for the determination of cinnamaldehyde and piperine in Dingguier Umbilical Paste.MethodsDetermination of Cinnamaldehyde：The C18 column (4.6 mm×250 mm，5 um)was used with the mobile phase of methanol-water (50∶50). The detection wave-length was 290 nm.Determination of piperine：The C18 column (4.6 mm×250 mm，5 um)was used with the mobile phase of acetonitrile-water (45∶55). The detection wave-length was 343 nm.ResultsCinnamaldehyde had the good linearity in the range of 0.1053～3.3696 μg(r=0.9999). Piperine had the good linearity in the range of 0.02592～0.25920 μg(r=0.9999).ConclusionThe method is proved to be simple,accurate and reliable,which can be used to control the quality of Dingguier Umbilical Paste.

Dingguier Umbilical Paste； High performance liquid chromatography； Cinnamaldehyde； Piperine； Content determination

国家重大新药创制项目(2011ZX09201-201-35)；山西省自然科学基金(2011011035-5)

101111 北京，亚宝药业集团股份有限公司北京药物研究院

杨晓宁(1977- )，女，硕士，工程师。研究方向：中药新药研发。E-mail：yn3528@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn. 1674-1749.2014.01.004

2013-10-12)