固定化硫酸盐还原菌选择性去除U(Ⅵ)的性能

唐振平，周 帅，王文涛，谢水波,2,*，高媛媛，马华龙

(1.南华大学 污染控制与资源化技术湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，湖南 衡阳 421001)

研究表明，在H2或乳酸盐等电子供体存在下，硫酸盐还原菌(SRB)可通过酶促作用直接还原/沉淀U(Ⅵ)，阻止U(Ⅵ)的迁移和扩散[5-8]。而要实现SRB生物还原/沉淀U(Ⅵ)的产业化，固定化技术的应用极为关键[5-7]。现有的报道多集中于游离态SRB还原U(Ⅵ)途径和环境因子影响的探讨[9-10]，但关于固定化SRB应用的研究较少；重金属离子和含氧阴离子等共存物对U(Ⅵ)还原过程的影响已有报道[1,10]，但对有机物的影响缺乏系统研究；利用SRB去除污染物时多针对U(Ⅵ)[5,6-9]、Zn及Cu[11-15]等单一目标，有机或无机体系下U(Ⅵ)/重金属的选择性去除尚未见报道。

本工作拟利用聚乙烯醇和海藻酸钠制备硫酸盐还原菌微球，探讨Zn2+和Cu2+等重金属离子，乙酸钠、草酸钠和柠檬酸钠等有机物对其还原废水中U(Ⅵ)的影响，并考察其选择性去除U(Ⅵ)的技术参数。

1 实验

1.1 主要试剂与仪器

聚乙烯醇、海藻酸钠，分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心；U3O8，分析纯，国家标准物质中心(北京)，标准铀溶液采用GBW04201方法配制。

T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；AA-6300型原子吸收分光光度计，日本岛津公司；TG16型高速离心机，长沙英泰仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司；79-1型恒温磁力搅拌器，江苏教育玻塑厂；HZQ-C型空气浴恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 SRB的分离与培养

自南华大学某下水道取黑色污泥，按5 g∶1 L将污泥接种入Postgate B液体培养基，置于35 ℃振荡培养箱中富集培养约1周。待液体培养基变黑且发出臭鸡蛋味后，采用平皿压层厌氧法对富集的SRB进行分离，即将琼脂浓度为2%的Postgate E固体培养基倒入已灭菌且编号的培养皿(90 mm×15 mm)中，分别按10-1、10-2、10-3和10-4稀释度吸取0.1 mL SRB富集液均匀涂布于固体培养基上。培养约3 d后，挑取内含黑色SRB菌落的琼脂块，采用Postgate C液体培养基对分离得到的SRB扩大培养约3 d。3次分离培养后的SRB菌体经离心(8 000 r/min，10 min)、冲洗(2.5 mg/L NaHCO3缓冲液，100 mL)后，置于盛有100 mL 2.5 mg/L NaHCO3缓冲液的150 mL血清瓶中，于4 ℃冰箱内保存。最终SRB菌悬液浓度约为35 g/L(以菌体干重计)。

1.3 固定化SRB微球的制备

将“聚乙烯醇-硫酸钠-硼酸法”[16]进行适当改进后用于制备固定化SRB微球。分别称取8 g聚乙烯醇和0.5 g海藻酸钠于100 mL烧杯中，再加入无菌水75 mL，加热至其完全溶解，冷却至35 ℃。加入25 mL上述SRB菌悬液，搅拌约30 min至其混匀。混合液中聚乙烯醇、海藻酸钠和SRB最终浓度分别为8、0.5、0.875 g/mL。用注射器将此混合液滴入盛有200 mL的CaCl2(2 g/mL)和饱和硼酸(6 g/mL)溶液(交联剂Ⅰ)的烧杯中，成球后用磁力搅拌器轻微搅动1.5 h。之后，将过滤后的微球转移至0.5 mol/L硫酸钠溶液(交联剂Ⅱ)中，再用磁力搅拌器轻微搅动2.5 h，倾去硫酸钠溶液，即得到成型的固定化SRB微球。最后，用无菌水冲洗微球2～3次，于4 ℃冰箱中保存备用。保持其他条件不变，不添加SRB菌悬液，采用以上方法制备空白微球。

1.4 实验方法

图1 厌氧培养装置

在150 mL血清瓶中分别加入100 mL上述培养液，用0.1 mol/L的NaOH和0.01 mol/L的HCl调pH值至6.0，于35 ℃下振荡培养，定时取样分析。培养过程中不添加酵母浸膏、维生素C等营养物质，以限制SRB生长，消除U(Ⅵ)还原的干扰因素[17]；充高纯氮气和二氧化碳混合气(V(N2)∶V(CO2)=4∶1)控制厌氧条件。

1) 固定化SRB还原U(Ⅵ)的单因素实验

初始pH值影响实验：pH值设为2.0～6.0，设置梯度为1.0。

微球投加量影响实验：通过微球投加量控制菌体量(每g微球约含0.071 g SRB，以干菌计)，微球投加量设为3～7 g，设置梯度为1 g。

2) 共存污染物对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响实验

Zn2+和Cu2+浓度对U(Ⅵ)还原的影响实验：分别加入25、50、100、120、140、150 mg/L Zn2+或Cu2+，以无外加重金属离子试样液为空白对照。

有机物对U(Ⅵ)还原的影响实验：分别加入10 mmol/L乙酸钠、草酸钠以及柠檬酸钠3种有机物，以无外加有机物作为空白对照。

3) 固定化SRB选择性去除U(Ⅵ)实验

间接选择性去除U(Ⅵ)实验：分别加入50 mg/L Zn2+、50 mg/L Cu2+及10 mmol/L柠檬酸钠。

1.5 分析方法

2 实验结果与讨论

2.1 固定化SRB还原U(Ⅵ)的实验结果

1) 初始pH值对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响

初始pH值对U(Ⅵ)去除率的影响示于图2。由图2可看出，初始pH值为2.0时，96 h内U(Ⅵ)去除率始终低于20%；随着初始pH值的升高，固定化SRB对U(Ⅵ)的还原能力增强，当初始pH值从2.0升至6.0时，实验96 h后U(Ⅵ)去除率从17.65%上升到94.76%。当初始pH值为3.0～6.0时，U(Ⅵ)的生物还原过程主要发生在前24 h内。

图2 初始pH值对U(Ⅵ)去除的影响

本课题组[1]曾探讨了初始铀浓度20 mg/L、温度35 ℃条件下pH值对游离态SRB还原U(Ⅵ)的影响。结果表明，当pH值为2.0或3.0时，6 d后U(Ⅵ)去除率均低于10%；当pH=6.0时，6 d后血清瓶中U(Ⅵ)几乎全部被还原。可见，在近中性环境中，SRB固定前后还原U(Ⅵ)的能力均较强；SRB经固定化后对低pH值的缓冲作用有所增强。这主要是由于大量SRB菌体被包裹在微球内部，削弱了强酸性环境对其还原酶体系生物学活性的抑制作用，同时降低了H+和U(Ⅵ)对SRB细胞壁上有限负电性活性部位的竞争，从而维持了其对U(Ⅵ)的还原能力[1]。为维持U(Ⅵ)的高效还原，后续实验均选择pH值为6.0。

2) 微球投加量对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响

微球投加量对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响实验结果示于图3，空白微球在24 h内对U(Ⅵ)的去除情况示于图4。分析图3可知，pH值为6.0时，U(Ⅵ)的去除主要在于微生物的活动，且发生在前24 h内。这是由于初始阶段电子供体充足，微生物代谢活动旺盛，U(Ⅵ)还原率增大显著；24 h后随电子供体的消耗，U(Ⅵ)还原率的增大趋于平缓。当微球投加量为6 g/L(相当于菌体投加量0.42 g/L)时，48 h内U(Ⅵ)还原率高达94.57%。超过该值，U(Ⅵ)还原效率随微球投加量的增加变化不大。这说明，对于U(Ⅵ)浓度为15 mg/L的溶液，6 g/L微球投加量已足够。此外，由图4可看出，空白微球对U(Ⅵ)也有一定的吸附作用，这可能与微球的多孔结构有关[18]。

图3 微球投加量对U(Ⅵ)去除的影响

图4 空白微球投加量对U(Ⅵ)去除的影响

2.2 共存污染物对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响

1) 重金属离子对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响

图5、6分别为不同Zn2+和Cu2+浓度下，固定化SRB还原U(Ⅵ)的情况。从图5、6可知，当初始Zn2+或Cu2+浓度在25～120 mg/L范围时，U(Ⅵ)还原动力学曲线与空白对照组差异较小，在96 h后U(Ⅵ)去除率可达94%左右，说明Zn2+或Cu2+浓度在0～120 mg/L范围内对U(Ⅵ)的还原影响很小。当初始Zn2+或Cu2+浓度升高至140 mg/L时，U(Ⅵ)还原受到不同程度的抑制，而当其达到150 mg/L时，U(Ⅵ)浓度在初期稍有下降，随后保持稳定，表明U(Ⅵ)还原受到完全抑制。实验中发现，96 h后开启初始Zn2+或Cu2+浓度分别为25、50、100、120 mg/L和空白组血清瓶，均有较浓的臭鸡蛋味气体产生，且部分微球变黑。而初始Zn2+或Cu2+浓度为150 mg/L时，血清瓶中并未出现这两种现象。由此推断，Zn2+或Cu2+对SRB的毒阀值约为150 mg/L。Azabou等[11]和Jalali等[12]研究发现，Zn2+或Cu2+浓度高于150 mg/L时，对SRB具有致死作用，这与本实验结果基本一致。

图5 Zn2+浓度对U(Ⅵ)去除的影响

图6 Cu2+浓度对U(Ⅵ)去除的影响

重金属对SRB还原U(Ⅵ)的影响主要表现在其对SRB的毒害作用。Garcia等[14]研究表明，pH=7.0，Cu2+浓度为25、50、100 mg/L时，接种SRB 21 d后，Cu2+去除率高达99%，且产生黑色沉淀；当Cu2+浓度增至200 mg/L时，细菌未见生长。Kieu等[13]在探讨半连续搅拌槽反应器中SRB对重金属离子的去除效果时也得到了类似结论。Utgikar等[15]则报道，Zn2+和Cu2+对SRB的毒阀值分别为12 mg/L和20 mg/L。本课题组[1]早期在研究Zn2+和Cu2+对U(Ⅵ)还原的影响时也发现，Zn2+和Cu2+抑制阀浓度分别为15 mg/L和25 mg/L。究其原因主要在于，重金属对SRB的毒阀值和抑制程度受环境影响(如细胞周围的物化环境、SRB种系组成及生物反应器构建情况等)较大[13]。此外，大量研究[16,18]表明，微生物经包埋固定可有效缓冲重金属离子的冲击作用，这也可能是本实验中Zn2+和Cu2+浓度毒阀值偏高的原因之一。

2) 有机物对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响

实验中，分别以乙酸钠、草酸钠和柠檬酸钠为研究对象，考察其对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响。实验结果示于图7。由图7可看出，草酸钠和柠檬酸钠对U(Ⅵ)的还原存在不同程度的抑制作用，乙酸钠的影响较小。24 h内，与空白对照组相比，乙酸钠使U(Ⅵ)去除率升高约3%，而草酸钠和柠檬酸钠分别使U(Ⅵ)去除率降低约61%、76%。

图7 有机物对U(Ⅵ)去除的影响

Ganesh等[19]通过在有机物存在条件下降解硫代硫酸盐的实验证实，有机物对U(Ⅵ)还原过程的影响差异不在于有机物对SRB产生的不同毒性。此外，在考察有机物对脱硫弧菌还原U(Ⅵ)的影响时还发现，乙酸钠、草酸钠和柠檬酸钠等有机物浓度均未显著降低，进而说明U(Ⅵ)还原趋势的差异也不在于SRB对有机物的选择性降解。结合上述分析及表1可知，有机物对固定化SRB还原U(Ⅵ)的影响差异主要在于有机配体的不同络合能力(柠檬酸钠>草酸钠>乙酸钠)。由于多齿配体有机物可与U(Ⅵ)络合，限制了U(Ⅵ)的还原[20]。

2.3 固定化SRB选择性去除U(Ⅵ)实验

SRB除通过酶促作用直接还原U(Ⅵ)外，还可利用代谢产物间接沉淀重金属[13,21]，两种机制示于图8。由于这两种机制是互斥的，适当优化处理条件有可能实现铀的选择性沉淀，这对于修复铀污染和回收铀资源具有现实意义。

a——乳酸氧化过程；b——SRB通过酶促作用直接去除U(Ⅵ)的过程；c、d——SRB利用代谢产物沉淀去除重金属的过程

1) 固定化SRB直接选择性去除U(Ⅵ)实验

图9 固定化SRB直接选择性去除U(Ⅵ)

表1 有机配体类型及络合特性[19]

2) 固定化SRB间接选择性去除U(Ⅵ)实验

图10 固定化SRB间接选择性去除U(Ⅵ)

在柠檬酸钠存在情况下，Zn2+、Cu2+及U(Ⅵ)的去除实验结果示于图10。从图10可看出，在72 h内，Zn2+和Cu2+的去除率分别达到97.54%、95.48%，而U(Ⅵ)的去除率仅为12.07%。可见，通过引入柠檬酸钠，有利于重金属离子(Zn2+和Cu2+)的选择性沉淀。究其原因，U(Ⅵ)可与有机物形成可溶性络合物，而金属硫化物不具备这一性质[19]。结合前述分析可知，适当添加有机物有利于选择性沉淀重金属。当多齿配体有机官能团通过生物或光降解后[25]，可利用直接法进一步还原/沉淀去除U(Ⅵ)。

3 结论

1) 在U(Ⅵ)还原过程中，硫酸盐还原菌经聚乙烯醇和海藻酸钠固定后对pH值的缓冲能力显著增强。当pH值为3.0～6.0时，固定硫酸盐还原菌可高效、稳定地还原/沉淀U(Ⅵ)。在U(Ⅵ)浓度为15 mg/L、微球投加量为6.0 g/L及温度为35 ℃的条件下，反应96 h后U(Ⅵ)去除率达到94.67%。

2) 当Zn2+或Cu2+浓度低于100 mg/L时，U(Ⅵ)还原未受显著影响；而当Zn2+或Cu2+浓度增至150 mg/L时，U(Ⅵ)还原被完全抑制。

3) 乙酸钠、草酸钠和柠檬酸钠3种有机物对固定化硫酸盐还原菌还原U(Ⅵ)的影响存在较大差异。当乙酸钠等单齿配体有机物存在时，U(Ⅵ)可被完全还原，而多齿配体有机物(草酸钠和柠檬酸钠)存在时，会延缓甚至抑制U(Ⅵ)的还原。

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