温瑞塘河沉积物的生物毒性表征研究

宋 力,蒋桂芳,黄民生,李 强(.重庆市环境材料与修复技术重点实验室,重庆 40260；2.华东师范大学资源与环境学院,上海 200062)

温瑞塘河沉积物的生物毒性表征研究

宋 力1,2,蒋桂芳1*,黄民生2*,李 强1(1.重庆市环境材料与修复技术重点实验室,重庆 402160；2.华东师范大学资源与环境学院,上海 200062)

利用淡水型发光细菌青海孤菌的一个变种 Q67和热带爪蟾胚胎对温瑞塘河沉积物浸出液生物毒性检测分析.沉积物相对发光强度平均值为63.3%,属中等生物毒性,最高发光强度为81.9%,最低发光强度为40.6%.沉积物浸出液的发育毒性结果为胚胎平均孵化率75.98%,最低点为42.5%,最高点为100%;胚胎成活率平均值为83.77%,最低值为66.25%,最高值为100%;平均致畸形率为16.6%,4个采样点无致畸现象,最大致畸性率为36.3%;爪蟾的平均体长为3.58cm,最小体长2.64cm,最大体长4.06cm.工业园区、城市生活与工厂混杂区,河流交汇且易于沉积区域生物毒性大,在源头区及单一生活污染区生物毒性小.

发光细菌；热带爪蟾胚胎；沉积物；生物毒性；温瑞塘河

河流、湖泊沉积物是污染物的“源”与“汇”,污染物在风浪或外力作用下再悬浮从而影响河流与湖泊的水质[1].沉积物中有毒有害物质的含量常被用作判断河流湖泊水环境质量标准[2].生物毒性测试直接测定沉积物毒性大小,评价污染物在河道累积对水环境产生的生物毒性,是研究水体污染的一种重要手段[3].温瑞塘河是典型的城市平原河网,集景观、运输、农业灌溉、饮用水于一体,流域内是温州市人口与工业聚集区,皮革及其制品、机械制造与五金、服装与印染、塑料制品、电镀等中小企业十分发达.大量的污染物直接排入或随地表径流进入到温瑞塘河网水系之中,温瑞塘河河网(2007～2011)的水质监测断面多数处于劣Ⅴ类[4].目前对温瑞塘河的研究主要是对沉积物重金属污染及水体污染的评价[1],杨波[5],陈瑞瑞等[6]针对支流九山河、山下河进行生物毒性的研究,而针对整个流域的生物毒性的研究未见报道.

发光细菌作为指示生物开展生物毒性检测分析,具有简便、快速、灵敏、廉价等优点,目前应用广泛[7-8].爪蟾胚胎致畸实验(Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus, FETAX)主要通过分析胚胎的孵化率、存活率、畸形率和生长抑制等指标表征样品的毒性强弱[9-10].

为了揭示与深入分析温瑞塘河流域沉积物受污染的生物毒性大小,利用淡水型发光细菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensis sp.nov)的一个变种Q67和热带爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎进行生物毒性检测分析,以期为温瑞塘河治理特别是是否清淤提供参考依据.

1 样品采集

采样时间为 2011年 4月 22～27日,利用TATO天泰正合MM9手持GPS定位仪定位,在温瑞塘河流域共设置29个采样点,采样点见图1.柱状采样器(可采深度≥50cm)采样,并遵循河流采样技术导则(HJ/T52-1999).

图1 温瑞塘河采样点示意Fig.1 Sampling sites in Wenruitang River basin

2 实验部分

2.1 测试生物

青海弧菌 Q67菌样(vibrio qinghaiensis),热带爪蟾胚胎.

2.2 沉积物浸出液提取

2.2.1 发光细菌试验 按沉积物与超纯水的质量比1:3稀释,常温振荡12h,静置12h,取上清液作为沉积物浸出液进行发光细菌测试[11].

2.2.2 热带爪蟾胚胎致畸试验 按沉积物与热带爪蟾养殖用水(自来水经市售净水器处理),按照1:4的体积比混合后装入500mL的棕色瓶中,密封后置于振荡机上振荡 24h,震荡机的条件控制设置为:100r/min,常温.然后静置24h,提取上清液进行实验[5,16].

2.3 利用胚胎进行生物毒性实验

2.3.1 胚胎的获取 挑选性成熟热带爪蟾8对,人工注射绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导产卵.每对爪蟾均注射2次HCG;挑选NF10～11阶段且发育正常的胚胎进行实验.

2.3.2 胚胎生物毒性测试 采用24孔板的培养皿进行胚胎培养实验,以养殖用水为对照,实验组和对照组各设4个平行,每个平行样选取10个挑选胚胎.胚胎暴露条件:多功能培养箱,25℃,24h更换1次培养暴露液,在24h后将未孵化的胚胎挑出,并记录胚胎孵化数,在48h后统计孵化后胚胎存活数与死亡数.将存活胚胎用 100mg/L MS-222麻醉液处理并固定于4%的甲醛溶液中.取固定在甲醛溶液的胚胎,在 Nikon解剖镜下观察胚胎的生长发育状况,采用NikonDS-SM型显微镜拍摄系统进行拍照.

2.3.3 数据统计 孵化率为 24h后孵化胚胎个数的百分比;存活率为48h后存活胚胎个数的百分比;体长:胚胎头部至尾尖的水平距离;畸形率:48h后胚胎畸形个体数占总存活个体数的百分比.本实验数据用SPSS16.0和origin8.0进行数据统计分析.

2.4 利用发光细菌测试实验方法

1) 取菌种冻干粉加入质量浓度为 3%生理盐水10mL中,充分摇匀后,放置在20℃下30min左右进行细菌复苏制备菌液;取 2mL测试液,依次加入 20μL菌液至测试管中,充分混匀,每隔15min左右,用BHP9511型水质毒性分析仪测定其相对发光率,并以2mL的3%生理盐水作为空白对照组,每个测试样设置3组平行样.

2) 采用 EC50法对所得的生物毒性的数据进行有效分析评价.用直线内插法求出相对发光率为50%时所对应的待测水样中ZnCl2的浓度,利用 ZnCl2的浓度来评价各待测水样的毒性大小.Y=-16.056χ+96.068,其中 R2=0.9716,相对发光强度计算如式(1).

从图4可以看出,随着通信半径的增加,网络连通性提高,所以各算法的平均定位误差均降低,本文定位算法平均定位误差始终保持最小,优于其他算法。可以看出在相同的定位误差下,本文算法所需要的通信半径最小,通信半径越小,能耗越小,在同等条件下,本文算法可以节约能耗,延长网络寿命,降低网络维护成本。

式中:I为相对发光强度;L1为正常发光强度;L2为与毒物作用后的发光强度.

其中毒性评价标准见表1.

表1 毒性评价分级标准[11]Table 1 rating standard of toxicity[11]

3 结果与讨论

3.1 发光细菌测试沉积物的生物毒性分析

由图 2可知,温瑞塘河沉积物相对发光强度的平均值 63.3%,最高发光强度为 81.9%,最低发光强度为 40.6%,其生态毒性评价中处于较大毒性的点有4个点,分别是1#、2#、7#、8#点这些点处于机械工业园区,与城市河道交汇区. 22#,23#,24#处于轻微毒性,位于温瑞塘河源头区,受工业生产和生活污染相对较小,其余22个样点处于中等生物毒性等级,由于温瑞塘河属于典型的平原城市河网,水流相对较缓慢,污染物易于沉积,同时受到工业生产和城市生活污染的双重影响现象明显,污染物的组成成分复杂,再加上曾经的管理落后等历史原因,导致其沉积物的污染较重,特别是重金属的影响,刘赞[12],雷炳莉[13]的相关研究也证实沉积物受污染的污染物组成越复杂其生物毒性也越强. Ho等[14]的研究结果显示,沉积物产生生物毒性主要受到氨氮、有机物和重金属 3类物质的影响,产生生物毒性的比例为有机物占8%,有机物+氨氮+重金属占8%,有机物+氨氮占 23%,有机物+重金属占 8%,氨氮+重金属占15%,重金属占15%.董小蓉等[15]研究指出水中微量有机污染物能对生物形成致畸变,产生生物毒性.王子健等[16]指出沉积物生物毒性大小受污染物质影响种类有待进一步细化,实验用测试生物根据其敏感性对受试物质也有待进一步研究.

图2 沉积物生物毒性分析与评价等级Fig.2 Sediment analysis and evaluation of biological toxicity

3.2 沉积物提取液对爪蟾胚胎孵化率的影响

由图 3可知,沉积物提取液对爪蟾胚胎孵化产生影响,孵化率最低的点仅为 42.5%,孵化率最高点为100%,平均孵化率75.98%.根据单因子方差分析实验组与对照组比较,存在显著性差异点21个点,而其中在 2#点,孵化率为 0,其结果占约75%的样点对爪蟾胚胎的孵化产生影响.在热带爪蟾胚胎外侧有保护膜组织,胚胎受精后保护膜组织会逐步分解,在本研究中可能存在保护膜对热带爪蟾胚胎孵化产生保护作用,胚胎的整体孵化率较高,部分点的孵化率达到 100%,但是在一些点,沉积物提取液对两栖类胚胎存在较强的发育毒性.1#、7#、8#、25#、26#、27#、28#点处在城市河道人口聚集区域,及河道交汇区与工业区域,其污染物来源相对复杂,生物毒性较大,导致胚胎的孵化率存在显著性的差异.不具有显著差异性的点11#、21#、22#、23#、24#、25#,均处于温瑞塘河源头区,农业区的孵化率高,与其污染物相对单一,主要受农业与生活的污染,污染程度相对低.杨波[5]在对温瑞塘河支流山下河、九山河沉积物及长江口沉积物利用爪蟾胚胎的检验与本研究有相似的结论,复杂的污染环境对胚胎孵化产生影响.

图3 暴露于沉积物提取液48h后热带爪蟾胚胎的孵化率Fig.3 Effects of sediment extracts on hatching of embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure Each vertical bar represents a mean of four replicates, and error bar represents standard deviation

3.3 对爪蟾胚胎成活率的影响

由图 4可知,胚胎的成活率最低值 66.25%,成活率最高值为100%,平均值83.77%,单因素显著性分析显示 1#、7#、8#、27#、28#呈极显著性差异,9#、18#、26#呈显著性差异,其余各点成活率与对照组无明显差异,沉积物提取液对成活率影响不明显,可能存在实验中对胚胎是否孵化认定,对孵化不明显的胚胎去除,优质爪蟾胚胎孵化后对毒性的耐受性提高,成活可能性增大.

图4 暴露于沉积物提取液48h后热带爪蟾胚胎的成活率Fig.4 Effects of sediment extracts on survival of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

图5 暴露于沉积物提取液48h后热带爪蟾胚胎的畸形率Fig.5 Teratogenic effects of sediment extracts on embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure

由图 5可知,温瑞塘河沉积物提取液平均致畸形率为 16.6%,最小畸形率为 0,最大致畸性率为 36.3%.其结果整体的平均值比杨波等[5]对山下河、九山河的研究结果偏小.在本研究中山下河与九山的结果为13.9%和20.4%其春季的结果一致.具有极显著性点 7#、8#、9#、28#、19#,这些点的沉积物的重金属污染评价属于污染严重等级,污染严重的区域,其致畸率相对较高.在本研究中,发现的主要畸形现象如图6.

图6 热带爪蟾胚胎48h后主要的畸形表型Fig.6 Major malformation phenotypes of Xenopus tropicalis after 48h for exposure

在暴露组中能够观察到各种类型的畸形特征,主要的畸形表型包括:眼睛畸形、躯干肿大、心包水肿、背鳍变窄、脊索弯曲、泄殖腔扩张、泄殖腔肿大、皮肤色素减少、皮肤色素沉着、发育延迟等现象,在畸形现象表征中,在一个胚胎生长发育中也表现出多种畸形现象如色素减轻,泄殖腔肿大、眼睛受损、尾鳍变窄等.这与Shi等[17]、陈瑞瑞等[6]在研究长江口沉积物与温瑞塘河山下河、九山河的研究结果具有相似性,由于沉积物样品组成物质的复杂性和多变性,导致其畸形的主要因素确定具有难度.

3.5 对爪蟾胚胎生长体长的影响

由图7可知,爪蟾的平均体长为3.58cm,最小体长2.64cm,最大体长4.06cm.与对照组的单因子显著性分析显示,在4#、21#、22#、24#、25#点体长不具有显著的差异性,这些点均处于温瑞塘河的源头区与农业区域,受污染相对较小,污染物也单一.其中有22个采样点均存在显著性差异,温瑞塘河沉积物79%的采样点提取液对爪蟾胚胎生长产生影响.这些点处于受工业生产,及生活的影响,但位于城市生活区20#点爪蟾胚胎体长无差异,可能提取液中的毒性物质在抑制胚胎,杨波[5]在研究九山外河的实验中也发现该现象存在.

图7 暴露48h后沉积物提取液对热带爪蟾胚胎生长的影响Fig.7 Effects of sediment extracts on growth of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

4 结论

4.1 温瑞塘河沉积物相对发光强度的平均值63.3%,属于中等生物毒性,最高发光强度为81.9%,最低发光强度为40.6%.

4.2 对青海弧菌(Q7)产生生物毒性在区域分布中,工业园区、城市与工厂混杂区域高于源头区及农业区域.

4.3 热带爪蟾平均孵化率 75.98%,最低点孵化率为 42.5%,最高点孵化率为 100%;胚胎的成活率平均值 83.77%,最低成活率为 66.25%,最高成活率为100%;平均致畸形率为16.6%,4个采样点无致畸现象,最大致畸性率为 36.3%;爪蟾的平均体长为 3.58cm,最小体长 2.64cm,最大体长4.06cm.

4.4 在污染源复杂与污染严重区域如工业园区与城市生活区,河流交汇易于沉积的区域对爪蟾胚胎的发育生长影响大,在河流的源头区及污染源单一生活污染区域的影响小.

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致谢：本论文实验中发光细菌与热带爪蟾胚胎由华东师范大学朱文杰教授、施华宏研究员友情提供,硕士研究生杨波参与部分实验,在此表示感谢.

Biotoxicity characterization of sediments from Wenruitang River

SONG Li1, JIANG Gui-fang1*, HUANG Ming-

The biotoxicity of sediments from Wenruitang River was characterized and analyzed using luminescent bacteria Vibrio qinghaiensis sp. Nov-Q67 and Xenopus tropicalis embryos. The maximum, minimum and average luminous intensity of Q67was 81.9%, 40.6% and 63.3%, respectively, which indicated moderate biotoxicity. In terms of the developmental toxicity of the sediment leachate, the average, maximum and minimum hatching rate of the Xenopus tropicalis embryos was 75.98%, 100% and 42.5%, respectively. The average, minimum and maximum survival rate of the embryos was 83.77%, 66.25% and 100%, respectively. Four sites among all sampling points did not show embryos malformations. The average and maximum teratogenic rate of the embryos was 16.6% and 36.3%. The average, minimum and maximum body length of the embryos was 3.58, 2.64 and 4.06cm, respectively. Sediments collected from combined industrial and residential area exhibited significant biotoxicity, while sediments from the river source area and/or isolated residential area had relatively low biotoxicity.

luminescent bacteria；Tropicalis xenopus embryos；sediment；biological toxicity；Wenruitang River

X171.5

A

1000-6923(2014)09-2374-06sheng2*, LI Qiang (1.Chongqing Key Laboratory of Environmental Material and Remediation Technologies, Chongqing 402160；2.College of Resources and Environmental Science, East China Normal University, Shanghai 200062). China Environmental Science, 2014,34(9)：2374～2379

宋 力(1979-)男,重庆酉阳县人,讲师,博士,主要从事水资源利用与水环境污染控制的研究工作.发表论文10篇.

《中国环境科学》2012年度引证指标

《中国环境科学》编辑部

2014-01-20

国家科技重大水专项(2009ZX07317-006);重庆市教委项目(KJ121207);重庆文理学院科研项目(Y2010HH46)

* 责任作者, 讲师, songlicq@163.com,教授,mshuan@des.ecnu.edu.cn

根据《2013年版中国科技期刊引证报告(核心版)》,《中国环境科学》2012年度引证指标继续位居环境科学技术及资源科学技术类科技期刊前列,核心影响因子1.657,学科排名第1位,在被统计的1994种核心期刊中列第21位;综合评价总分72.0,学科排名第3位.《中国科技期刊引证报告》每年由中国科学技术信息研究所编制,统计结果被科技管理部门和学术界广泛采用.