黄花蒿小孢子的发生和雄配子体的形成

荆风雪，朱卫平，张学文

（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128）

黄花蒿小孢子的发生和雄配子体的形成

荆风雪，朱卫平，张学文*

（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128）

黄花蒿是当今优良抗疟药青蒿素的药源植物。采用石蜡切片法观察了黄花蒿小孢子发生及雄配子体发育的细胞学过程。黄花蒿花药为4室结构；横切面呈蝴蝶状排列；花药壁发育为典型单子叶型；花药壁中层在花药发育的较早期解体，其绒毡层由腺质型绒毡细胞组成，在花粉成熟前绒毡层细胞原位解体；花粉母细胞在减数分裂过程中，细胞分裂同步相差1～2个细胞周期，其细胞质分裂则为同时型；经2次分裂后形成的四分体为正四面体型；花药开裂前的成熟花粉粒为2细胞型，含1个营养细胞和1个具2个细胞核的生殖细胞。

黄花蒿；小孢子；雄配子体

黄花蒿（Artemisia annua L.）为菊科蒿属草本植物。20世纪70年代我国科技工作者首次从黄花蒿中分离出抗疟特效药青蒿素。青蒿素类抗疟药具有起效快、疗效好、毒性低的特点，特别是对脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾疗效更为突出，已成为疟疾治疗的主要药物［1，2］。青蒿素类药物对血吸虫病、血丝虫病、无名高烧等也有很好的疗效。此外，还有研究［3］表明，青蒿素对癌症、心律失常等也有潜在的应用效果。目前黄花蒿仍为青蒿素的惟一药源［4］，随着青蒿素需求量增加，通过人工杂交培育高产量、高含量青蒿素黄花蒿品种具有十分重要的意义。为此我们开展了黄花蒿小孢子发生和花粉发育的观察，以期为黄花蒿的种子繁殖、杂交育种提供生殖生物学方面的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄花蒿（Artemisiae annuae L.）为作者选育的高青蒿素含量黄花蒿新品种“黄花蒿428-A”。2011年3月上旬播种于湖南农业大学实验基地，5月上旬移栽，移栽密度为50 cm×100 cm。8月中旬现蕾开始，选取不同发育时期的花序用FAA（70%乙醇、冰醋酸、甲醛混合液）固定，直到9月下旬开花结束。材料保存于FAA中。

1.2 方法

采集的花序用测微尺测定花序的直径，根据花序直径大小分组固定。

选取各组花序10个，用爱氏苏木精进行整体染色5 d，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片（厚度10μm），展片，脱蜡，透明，中性树胶封片。封片后在Olympus-BX51显微镜下观察，用Olympus显微摄影系统拍照。

2 结果与分析

2.1 花序直径与花药发育时期的相关性

黄花蒿的花为管状花，形成头状花序（图1-1），1个花序中包含10～20朵左右的小花。花序直径与其雄蕊的发育具有一定的相关性。花序直径与花药发育时期对应关系如表1。

黄花蒿小花直径小于1.28 mm是花粉母细胞发育和减数分裂时期；小花直径为1.28～1.45 mm时，为单核花粉发育期，此后是花粉成熟期。

2.2 花药壁的发育

黄花蒿花药有4室，横切面呈蝴蝶状（图1-2）。早期花药的细胞细胞质浓，主要由分生组织细胞构成。随着花药的不断发育，以后在花药4个角隅处的表皮下分化出1列细胞，比周围细胞体积大，细胞质浓，分化为孢原细胞（图1-3）。孢原细胞平周分裂1次形成2层细胞，外层为初生周缘细胞，内层为初生造孢细胞（图1-4）。初生周缘细胞平周分裂1次形成2层次生周缘细胞（图1-5）。2层次生周缘细胞再平周分裂1次形成4层细胞，之后最外的1层分化为药室内壁，最内的1层分化为绒毡层，中间2层分化为中层（图1-6）。发育完整的药室壁由5层细胞构成，由外到内分别为：表皮、药室内壁、中层（2层）和绒毡层（图1-6）。据此推断，黄花蒿的花药壁发育类型为单子叶型［13］。花药壁各层继续发育，药室内壁细胞继续增大，细胞壁纤维化转变为纤维层。中层逐渐变得扁平（图1-7～8），在花粉母细胞二分体时期开始解体（图1-9）。初期绒毡层细胞与其他药壁细胞无明显差别（图1 -6），吸收营养物质后迅速增大，在次生造孢时期体积达到最大，细胞质浓厚（图1-7）。在花粉母细胞进入减数分裂后绒毡层细胞开始解体，细胞内储存的营养逐渐被花粉母细胞发育成雄配子体过程中所利用，到成熟花粉粒形成时，绒毡层细胞储存的营养被消耗殆尽（图1-9～10）。绒毡层细胞在原位解体，细胞质不流入到药室内，属腺质型绒毡层［13］。

2.3 小孢子产生和雄配子体形成

图1 黄花蒿小孢子发育过程

在初生周缘细胞发育成花药壁时，初生造孢细胞分裂产生大量次生造孢细胞（图1-4）。次生造孢细胞吸收营养物质迅速增大，逐渐发育成花粉母细胞（图1-6～8）。花粉母细胞体积较大，细胞核大，细胞质浓厚，液泡不明显，随后进入减数分裂（图1-7～8）。经减数分裂第1次核分裂形成二分体（图1-9）。减数第1次核分裂后，其细胞质不分裂（图1-9）。接着进入减数第2次分裂，第2次核分裂后进行细胞质分裂形成4个小孢子，即为四分体（图1-11）。细胞质的分裂属于同时型，4个小孢子被包裹在共同的胼胝质中，呈正四面体排列（图1-1）。胼胝质溶解，释放出4个小孢子，即单核花粉粒（图1-12）。单核花粉粒细胞壁薄，细胞质浓厚，细胞核位于细胞中央。随后单核花粉粒的细胞壁收缩，体型变得不规则（图1-12）。经过收缩期后，单核花粉粒变成球形，此时细胞质中出现小液泡，细胞核仍位于细胞中央（图1-10）。随后单核花粉粒小液泡融合成大的液泡，最后形成中央大液泡，细胞质和细胞核移向细胞边缘进入单核靠边期（图1-13）。进入单核靠边期后，单核花粉粒细胞核进行1次有丝分裂，形成营养核和生殖核，生殖核紧贴细胞壁（图1-14），之后再进行1次不均等的细胞质分裂，形成体积小、呈透镜状的生殖细胞和体积较大的营养细胞，形成尚未成熟的2细胞花粉（图1-14）。生殖细胞开始紧贴花粉粒壁，以后逐渐向营养细胞的细胞质中漂移，悬浮在营养细胞的细胞质中（图1-15）。到花药裂开，花粉散出，形成成熟的2细胞花粉。传粉后，生殖细胞在花粉管内再分裂1次，产生2个精细胞，形成3细胞花粉粒，即雄配子体。

3 讨论

1966年Davis［5］对菊科胚胎学特征进行了描述，认为花药壁的发育类型为双子叶型，绒毡层为变形绒毡层。后续对菊科植物药壁发育观察结果显示，多数菊科植物的药壁发育都是双子叶型［6～9］，但在某些菊科植物中发现了其他发育类型。例如胡铁锋［10］发现，牛膝菊花药壁发育过程中，2层次生周缘细胞不再进行平周分裂，外层直接发育成药室内壁，内层直接发育成绒毡层，发育完整的花药壁没有中层。笔者发现黄花蒿的花药壁具2层中层细胞，其发育类型属单子叶型，这些均有别于菊科植物普遍的双子叶型发育。就绒毡层类型来说，黄衡宇等［6］对小蓬草，刘建全等［11］对款冬的胚胎学研究认为，小蓬草和款冬的绒毡层类型为腺质绒毡层。笔者发现黄花蒿的绒毡层类型也为腺质绒毡层，均有别于菊科植物普遍的变形绒毡层。因此不同的菊科植物药壁发育类型和绒毡层类型存在差异。Pullaiah［12］指出，绒毡层类型是菊科具有重要系统学意义的胚胎学性状之一，药壁发育类型和绒毡层类型与菊科植物系统发育的关系有待对更多的菊科植物药壁发育进行研究。

多数菊科植物药壁的中层只有1层，而黄花蒿具有2层，与多数菊科植物的药壁发育类型不一致。本研究发现在花药发育过程中，中层和绒毡层先后解体，其营养成分被花粉母细胞发育成雄配子体的过程中所利用。中层细胞一般含有淀粉等营养成分［13］，中层细胞解体的时期比绒毡层要早，由此推测中层细胞解体过程中，将贮藏的营养物质提供给了绒毡层。而胡铁锋［10］研究牛膝菊花药结构发现，牛膝菊花药壁没有中层，并且认为缺少中层节省了在中层发育上所需的养分，将有限的营养物质尽可能多地提供给花粉粒的发育。目前有关菊科植物花药壁中层何时解体的研究不多。郑书馨等［7］认为黄顶菊花药壁的中层从花粉母细胞到四分体时期解体消失。本研究表明，黄花蒿花药壁的中层在花粉母细胞减数分裂期二分体时期解体。关于花药壁中层的发育和解体与绒毡层发育的关系研究得比较少，如果中层细胞解体，将贮藏的营养物质提供给了绒毡层，那么中层的发育与解体可能影响到绒毡层的发育，进而影响到花粉发育的营养供给，最终影响到花粉的育性，有关这方面的研究有待进一步加强。Davis［5］认为菊科植物的成熟花粉粒多为3细胞花粉粒。但胡铁锋［10］对牛膝菊和郑书馨等［7］对黄顶菊的胚胎学研究发现牛膝菊和黄顶菊的成熟花粉粒均为2细胞花粉粒。笔者发现黄花蒿的成熟花粉粒也为2细胞花粉粒，与胡铁锋和郑书馨等的研究结果一致。不同菊科植物的成熟花粉粒的类型存在差异。

［1］ 朱卫平，刘仲华，盛孝邦.黄花蒿腺毛状分泌腺的起源和发育［J］.湖南农业大学学报，2007，33（4）：416-418.

［2］ 屠呦呦，叶和春，杨 岚，等.青蒿及青蒿素类药物［M］.北京：化学工业出版社，2009.

［3］ 谭 涛，秦宗会，谭 蓉.青蒿素类药物的药理作用［J］.中国药业，2009，18（3）：63-64.

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［5］ Davis GL.Systematic Embryology of the Angiosperm［M］.New York：John Wiley and Sons Inc.，1966：89-93.

［6］ 黄衡宇，龙 华，李 鹂.小蓬草的胚胎学研究［J］.武汉植物学研究，2009，27（3）：233～241.

［7］ 郑书馨，任艳萍，王永周，等.黄顶菊小孢子发生与雄配子体发育的研究［J］.热带亚热带植物学报，2009，17（4）：321-327.

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［11］刘建全.款冬的胚胎学［J］.西北植物学报，2001，21（3）：520-525.

［12］Pullaiah T.Embryology of Compositae［M］.New Delht：Today’s and Tomorrow’s Printers and Publishers，1984：51-53.

［13］胡适宜.被子植物生殖生物学［M］.北京：高等教育出版社，2005.

Microsporogenesis and Male Gametophyte Development of Artem isia annua L.

JING Feng-xue，ZHU Wei-ping，ZHANG Xue-wen*
（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agriculutural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Artemisia annua L.is onlymedicine source plant of artemisinin，a very effective antimalarialmedicine.In this paper the conventional paraffin section was adopted to observation of themicrosporogensis and themale gametophyte development of A.annua.The results are as follow：The anther has4 chambers and organizes in a butterfly shape in its transection.The development of anther wall belongs to themonocotyledonous type.The twomiddle layers of anther wall change from thickness into thinness in the earlier stage of the anther development and disintegrate in the dyads stage of the pollen mother cell（PMC）.The tapetum，of which each cell always disintegrates in the original position，is the secretory type. The cytokinesis aftermeiotic division of PMC is simultaneous type，and themicrospore arrangement in the tetrad is tetrahedra1.Themature pollen grains，which contain 1 vegetative cell and 1 reproductive cell，belong to a 2-cell type.

Artemsisia annua；Microspore；Male gametophyte

S567.9；Q944.4

：A

1001-5280（2014）02-0186-04

10.3969／j.issn.1001-5280.2014.02.18

2013 12- 05

荆风雪（1985-），女，山东聊城人，硕士研究生，主要研究方向为细胞生物学，Email：jingxue2222＠126.com。*通信作者：张学文，教授，Email：xwzhang＠hunau.edu.cn。

湖南省科技厅计划项目（2013CK4015）。