青霉属生物中分离出的抗真菌四肽的固相合成

杨璐晶，王 露，李文娟，李仁武，王晓燕，胡宏岗 (第二军医大学,.研究生管理大队,.药学院，上海 00433)

随着人类社会的发展与进步，人口不断增加，环境污染日益严重，可供给人类生存所必需的农耕田逐年减少。因此，农作物的产率就极大的引起了人们的关注，而真菌感染正是影响农作物产率的一个重要因素。抗菌肽通常序列短，由微生物集体合成，是机体天然防御的一部分。抗菌肽可以抵御真菌入侵，对各种植物疾病有良好的作用[1]。因此，抗菌肽有可能成为一种新型农药用于现代农业[2]。

近期研究表明，从变灰青霉中分离得到的直链四肽D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH有显著的抗菌活性，该化合物对Fusariumvirguliforme(为大豆猝死综合征病原菌)的MIC达9.5×10-3μmol/L，其抗真菌能力优于市场上广泛使用的抗菌药物[3]，其化学合成方法尚未见报道。固相多肽合成是近年来迅速发展的一种快捷高效的获得多肽的方法。所以，本研究首次采用固相多肽合成，以2-氯三苯基氯树脂为固相载体，首先将C端的酪氨酸与树脂相连，再将其余3个氨基酸逐一与酪氨酸进行连接，合成完毕后将四肽从树脂上剪切下来，并脱去侧链上的保护，获得目标多肽。

1 仪器与试剂

1.1仪器 恒温磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)、旋转蒸发仪(LOOYE ZX98-1), 水浴锅(LOOYE ZX98-1) , 2ZX-4型旋片真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司) , 低温冷却循环泵(上海豫康科教仪器设备有限公司), 循环水式多用真空泵SHB-IIIA(上海豫康科教仪器设备有限公司), ZF7B三用紫外分析仪(上海康化生化仪器制造厂)，Selecta固相合成仪。

1.2试剂 Fmoc-氨基酸(吉尔生化)、2-氯三苯基氯树脂(CTC)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三氮唑( HOBt )、三氟乙酸( TFA)、N,N-二异丙基乙基胺( DIPEA )、三氟乙醇(TFE) 均购自上海吉尔生化有限公司；茚三酮、哌啶、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷( DCM)、N-甲基吡咯烷酮( NMP )均为市售分析纯试剂；乙腈(色谱纯，J&K)。

2 合成实验

2.1合成路线

图1 D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH合成路线

a:DCM/DIPEA, 3 h; b(1) :HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-D-Val-OH, 30 min, b(2):HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-Val-OH, 30 min;

b(3):HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-D-Phe-OH, 30 min; c:TFE/AcOH/DCM(1:1:8),1 h; d:TFA/DCM(1:3),30 min

2.2Fmoc-酪氨酸与树脂相连[4]取CTC树脂1.0 g(取代度为1.08 mmol/g)加入到固相合成反应管中，用DCM 30 ml浸泡30 min使CTC树脂充分溶胀，活化待用。随后加入Fmoc-Tyr(OtBu)-OH (749 mg，1.5 mmol)、二氯甲烷15 ml、DIPEA 0.42 ml，震荡反应3 h。反应结束后，将液体滤去，依次用甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，抽干待用。

2.3氨基酸的逐步连接 在上步反应树脂中加入20%哌啶-DMF溶液15 ml，震荡反应30 min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2 eq)与HOBt(3 eq)混溶于5 ml DMF溶液中，再加入DCC(3 eq)、二氯甲烷 15 ml，震荡反应30 min。并用20%哌啶-DMF溶液15 ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2 h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据多肽序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕。

2.4四肽的游离和脱侧链保护 本研究采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离。具体操作如下：在上步反应树脂中加入乙酸:三氟乙醇:二氯甲烷=1:1:8(V/V/V)30 ml，振荡反应1 h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品409 mg。并且在粗品中加入TFA:DCM=1:3(V/V)20 ml，搅拌反应30 min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品267.5 mg，收率47.0%，纯度大于95%。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ 9.22～9.20 (m, 1H, NH), 8.46 (d, 1H,J=9.2 Hz, NH), 8.32 (d, 1H,J=8.4 Hz, NH), 8.13 (d, 1H,J=9.2 Hz, NH), 7.32～7.20 (m, 5H, Ar-H), 7.00(d, 2H,J=8.4 Hz，Ar-H), 6.63 (d, 2H,J=8.4 Hz, Ar-H), 4.56～4.53 (m, 1H, α-H), 4.39～4.34 (m, 1H, α-H), 4.34～4.31 (m, 1H, α-H), 4.56～4.53 (m, 1H, α-H), 4.26 (t, 1H,J=7.5 Hz), 3.06～3.02 (m, 1H), 2.96～2.90 (m, 2H), 2.70～2.65 (m, 1H), 1.86～1.74 (m, 2H), 0.68～0.62 (m, 9H, CH3), 0.54 (d, 3H,J=6.8 Hz, CH3)，m/zC28H39N4O6[M+ H]+: 527.36。

3 结果与讨论

本研究通过4步反应合成得到了目标化合物D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH，终产物的合成收率为 47.0%。其结构经核磁和质谱确证，合成方法简便易行，反应条件温和，收率高，合成得到的目标化合物可用于抗真菌活性研究。

在用二氯甲烷洗涤树脂过程中，遇到过抽滤速度瞬间减慢的情况，经过分析可能原因是固相合成管在震荡时发生堵塞。在浓缩滤液得粗品的过程中，蒸发得不带固体粗品，经过分析可能的原因为粗品溶解在稀酸体系中，所以加入甲苯降低其溶解度，并且得到了多肽粗品。

抗菌肽的发现促进农业发展，使农作物产量有了进一步提高的可能。但是，在抗菌肽广泛应用于农业生产前，还需要验证和考虑很多问题。如需要进一步实验验证抗菌肽的安全性，需要考虑真菌等微生物对抗菌肽的耐药性等。所以，要想在农业生产上真正使用抗菌肽还需要进行很多研究。

【参考文献】

[1] Montesinos E, Bardaji E. Synthetic antimicrobial peptides as agricultural pesticides for plant disease control[J]. Chem Biodiver，2008, 5(7): 1225-1237.

[2] Chernysh S, Kim SI, Bekker G,etal. Antiviral and antitumor peptides from insects[J]. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(20):12628-12632.

[3] Bertinetti BV, Pea NI, Cabrera GM. An antifungal tetrapeptide from the culture ofpenicilliumcanescens[J]. Chem Biodiver，2009, 6(8): 1178- 1184.

[4] 胡春玲.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的固相合成[J]. 医药导报, 2011, 30(5):561-562.