维生素D受体基因的多态性与检测方法
2014-08-06游春华熊筱娟王清华陈万生高守红第二军医大学附属长征医院药学部上海00003宜春学院化学与生物工程学院江西宜春336000
游春华,熊筱娟,王清华,陈万生,高守红 (. 第二军医大学附属长征医院药学部,上海 00003;. 宜春学院化学与生物工程学院,江西 宜春 336000)
维生素D(Vit D)为人体自身不能合成的必需营养素,需要通过日光照射或食物摄入获得补充[1]。维生素D只有在体内经肝脏25羟化酶和肾脏25羟维生素D[25(OH)D]-1α-羟化酶作用下转化为有活性的1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3],才能最大程度地激活Vit D受体(VDR),发挥其生理作用[2]。
Vit D在人体正常生理或生化功能方面起着至关重要的作用。Vit D缺乏症在普通人群中的患病率已经成为一个重大的公共卫生问题,Vit D缺乏不仅与骨骼、肌肉疾病相关,还与免疫系统、肿瘤、糖尿病、肾脏、呼吸系统、神经精神等疾病相关。研究发现Vit D受体基因多态性会影响到Vit D的作用,可见Vit D与人类健康关系密切,在健康人群及患者中检测Vit D水平是很有必要的。25(OH)D已被公认为检测Vit D水平的主要指标。一般认为,Vit D缺乏的标准是血浆中25(OH)D浓度小于30 ng/ml,而大于100 ng/ml时会引起中毒[3]。目前检测25(OH)D水平的方法各有优缺点,国内外对Vit D受体基因多态性报道不多,笔者通过查阅大量国内外有关文献,介绍几种检测方法的利弊和Vit D受体基因多态性与疾病的关系,了解患者Vit D水平及Vit D受体基因变化情况的关系,从而指导临床医生合理用药。
1 Vit D与疾病的关系
研究表明,Vit D受体存在于人体各细胞中,包括骨骼肌细胞之外的免疫细胞、肿瘤细胞、心肌细胞等。Vit D与疾病的关系见表1。
在世界范围内Vit D缺乏已普遍存在,随着Vit D与疾病的关系建立,凸显了Vit D水平与健康关系的密切性。
表1 Vit D与疾病的关系[4]
2 Vit D受体基因多态性研究现状
目前发现Vit D代谢产物1,25(OH)2D3可能负责调控个体生长发育及人类疾病相关的200多个基因[5],基因多态性分别对应限制性内切酶Bsm I(位于第8内含子上)、Apa I(位于第8内含子上)、Taq I(位于第9外显子上)、Fok I(位于第2外显子上)的酶切位点。国内外相关研究报道如下:
2.1Bsm I位点 Ji等[6]的分析表明,Bsm I BB基因型和骨折之间在统计上有着显著的关联。Diego等[7]在研究VDR基因多态性对圣迭哥和智利1型糖尿病患儿的免疫应答的影响时,发现VDR基因(Bsm I)多态性和1型糖尿病有关。Zhang等[8]研究Vit D受体基因Bsm I多态性与中国汉族人群2型糖尿病肾病时得出结论,Vit D受体等位基因B(BB或Bb基因型)与汉族2型糖尿病患者大量蛋白尿有关,可能是早发糖尿病肾病的危险因素。Sara 等[9]研究唐氏综合征患者Vit D受体基因多态性时发现VDR基因Bsm I多态性的等位基因B在唐氏综合征患者中出现更频繁。 bb和BB基因型分别更频繁地出现在高个和寿命长的唐氏综合征患者中。这个结果指出VDR基因型可能会影响唐氏综合征患者的这两个表型特征。
2.2Apa I位点 Daisuke等[10]研究结果显示,VDR基因Apa I多态性与患人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)相关性脊髓病/热带痉挛性瘫痪(HAM/TSP)的风险有关,但这种基因多态性并不影响HTLV-Ⅰ原病毒在HAM/TSP患者 和HTLV-Ⅰ血清阳性携带者(HCs)中的负荷。Elisabeth等[11]研究结果显示,在患多囊卵巢综合征(PCOS)的妇女中,VDR基因Apa I AA基因型与其低水平雄性激素有关。
2.3Taq I位点 Yiannis等[12]在研究VDR Taq I基因多态性与希腊的人口肥胖相关性时,发现VDR Taq I等位基因T与肥胖有关,并建议在更大规模的独立群体中验证这一发现。Martelli等[13]研究在意大利人口中VDR Taq I多态性与慢性牙周炎的关联时表明在意大利人口中VDR Taq I多态性差异与慢性牙周炎和侵袭性牙周炎的发生与发展有关。对VDR基因多态性的研究可能会成为预防牙周炎及植入评估中必不可少的环节。
2.4Fok I位点 Syed 等[14]研究结果表明,克什米尔人多发性骨髓瘤与Fok I基因多态性有关,ff基因型与发展中的多发性骨髓瘤的风险性有关。
国内外研究结果显示,VDR基因多态性除与骨骼效应有关外,还与骨髓瘤、糖尿病、肥胖、牙周炎、前列腺癌等多种疾病之间存在相关性。然而在我国对VDR基因多态性相关研究较少,为此很有必要开展VDR基因多态性与疾病关系的相关研究。
3 25(OH)D水平检测方法概述
3.1放射免疫分析法 放射免疫分析法(RIA)是一种利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析法,几乎能应用于所有激素的分析(包括多肽类和固醇类激素)。于媛等[15]采用放射性免疫法检测82例慢性肾病(CKD)患者3~5期非透析患者的血浆25(OH)D与1,25(OH)2D3水平,发现CKD患者3~5期非透析患者普遍存在25(OH)D与1,25(OH)2D3缺乏。沈波等[16]选择复旦大学附属中山医院血液净化中心维持性透析患者224例,采用放射免疫测定试剂盒检测25(OH)D,结果发现血液透析人群中25(OH)D缺乏十分常见,且可能与心脏疾病、炎症、贫血的发生与发展相关。但它的不足之处在于:检测过程中容易产生放射性污染,对人体有损害,且操作烦琐,精确度相对较低,因此在临床应用上受到一定限制[17]。
3.2酶免疫分析法 酶免疫分析法(ELISA)是一种非放射性标记免疫分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示踪物,由高活性的酶催化底物显色或发光,达到定量分析的目的,是早期Vit D测定的主流方法,该法操作简单,节省人力。谷丽娟等[18]采用ELISA法测定48个不同严重程度2型糖尿病肾病患者的血清1,25-(OH)2D3水平,发现1,25-(OH)2D3可能与2型糖尿病肾病相关,并且能够在一定程度上反映其严重程度。闻萍等[19]选取南京医科大学第二附属医院肾脏病中心278例维持性血液透析(MHD)患者,采用ELISA方法检测患者血清25(OH)D的水平,并用多元回归分析法分析25(OH)D水平与患者临床指标间的相关性,结果发现Vit D缺乏和不足在MHD患者中发生率十分高,女性及心血管并发症的发生与之密切相关。李芬等[20]选择43例透析时间>3个月、病情稳定、已排除急性心血管事件的血液透析患者(MHD组),采用ELISA法测定25(OH)D水平,结果发现MHD患者Vit D缺乏的患病率较肾功能正常组明显增高。但ELISA法对基质效应敏感,容易与其他非目标化合物产生交叉反应,当患者服用维生素D2补充剂治疗Vit D缺乏时,酶疫法测定结果偏低,可能误导临床决策,带来Vit D中毒风险[21]。
3.3化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光测定技术与免疫反应相结合的检测分析技术,该法具有高灵敏度、高特异性、操作简单、自动化等优点。单咏梅等[22]依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)相关规定对LIAISON全自动化学发光仪测定25(OH)D的检测性能验证与评估,结果表明LIAISON全自动化学发光仪测定25(OH)D在精密度、分析灵敏度、功能灵敏度、线性范围、临床可报告范围等性能参数上均符合要求,可以应用于临床检测。Leino等[23]采用罗氏E170化学免疫分析法与其他方法测定25(OH)D时,发现CLIA法与LC-MS/MS、RIA法测得的浓度相当吻合,但CLIA法在低浓度范围分析灵敏度不高。
3.4LC-MS/MS检测法 LC-MS/MS符合现代临床实验室的工作流程,可完全满足临床检测方法准确性、特异性、检测通量的要求。LC-MS/MS法既能测定25(OH)D总量,又能检测25(OH)D2和25(OH)D3,具有非常高的检测特异性,且与维生素D代谢产物的质量评估方案[DEQAS]相吻合[24],被认为是“金标准”的检测技术。Higashi等[25]报道用LC-MS/MS法非侵害性地测定了唾液中25(OH)D水平及服用Vit D后唾液中25(OH)D增加水平,这种方法已成功用于临床研究。此外,LC-MS/MS的试剂用量少,可实现多成分同时检测。Mochizuki等[26]用LC-MS/MS法同时检测血浆中25(OH)D2和25(OH)D3,实验只用了25 μl血浆,并预测这种高通量检测法用于临床评价Vit D水平很有潜力。Guo等[27]用LC-MS/MS法定量测定血浆中包括25(OH)D在内的 12种类固醇,充分显示此法在临床的应用价值。上述4种检测Vit D方法的优缺点比较详见表2。
4 展望
Vit D缺乏已是一个全球性问题,我国人群Vit D水平也普遍偏低。Vit D缺乏除与骨骼效应有关外,还与非骨骼效应多种疾病相关联,如高血压、外周血管疾病、糖尿病、代谢综合征、冠脉疾病等。但Vit D缺乏患者的症状并不明显,难以发现,同时研究发现Vit D服用过多也会对人体造成相应的伤害,为此建立一种稳定、准确、灵敏的方法测定25(OH)D是很有必要的。目前,临床常用的方法测定25(OH)D常常出现不灵敏、准确度不高、个体间存在差异等问题。LC-MS/MS测定Vit D及代谢产物有望逐步发展成为临床上测量Vit D的最佳方法,为临床上尽早发现Vit D缺乏以及提醒患者及时补充Vit D具有实际的指导意义。
表2 4种不同检测Vit D方法的优缺点比较[24,28-30]
Vit D受体基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性上起到重要作用。为此通过研究Vit D受体基因多态性,可以了解个体对药物代谢的差异,结合Vit D水平,建立人体Vit D水平与Vit D受体基因多态性之间关系,从而更好地指导临床医生合理用药,最终达到个体化用药的目的。
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