胆囊癌组织中微淋巴管密度的检测意义

张斌斌，陈义钢，丁厚中*

（1.昆山市中医院病理科，江苏昆山215300；2.江苏大学附属昆山医院综合外科，江苏昆山215300）

胆囊癌组织中微淋巴管密度的检测意义

张斌斌1，陈义钢2，丁厚中2*

（1.昆山市中医院病理科，江苏昆山215300；2.江苏大学附属昆山医院综合外科，江苏昆山215300）

目的：探讨使用D2-40（淋巴管内皮细胞标志物）检测胆囊癌组织中微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的临床意义。方法：应用组织芯片和免疫组织化学（S-P法）技术以D2-40单克隆抗体检测59例胆囊癌（其中肝脏侵犯13例，淋巴结转移27例）的癌中心与癌周组织和6例正常胆囊组织中LMVD的表达，并分析其与胆囊癌病理参数的关系。结果：LMVD在胆囊癌周边组织中的表达明显高于正常胆囊组织和癌中心组织中的表达（P＜0.01）。在胆囊癌中，D2-40阳性表达与患者性别、年龄、肝脏侵犯无关（P＞0.05），而与胆囊癌的淋巴结转移及临床分期（Nevin分期）有关（P＜0.05）。结论：D2-40可以特异性识别人胆囊癌组织中微淋巴管内皮细胞，其标记的微淋巴管主要分布于癌周组织；LMVD可用来评估胆囊癌淋巴转移风险。

组织芯片；胆囊癌；D2-40

胆囊癌是预后较差的恶性肿瘤之一，早期易发生转移，一旦发现多为晚期［1］，其转移途径大多通过直接转移、淋巴道转移等，肿瘤细胞侵犯进入淋巴管及肿瘤内淋巴管侵犯（lymphatic vessel invasion，LVI）是肿瘤发生淋巴结转移的重要步骤［2－3］。以往外科手术大多主张行胆囊癌扩大根治术，而目前临床上对胆囊癌的外科大范围淋巴结清扫尚存在着不同争论［4］，因此有必要对胆囊癌组织、癌旁组织与正常胆囊组织中的淋巴管密度等进行相关研究，从而为外科淋巴结大范围清扫价值的讨论提供参考。2002年Kahn等［5］发现了一种比较特异的淋巴管内皮细胞标志物D2-40，其抗体对淋巴管上皮有较高的特异性和敏感性，可用于淋巴管形成和计数研究［6］。目前国内外对微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）与胆囊癌相互关系的研究较少，本研究以D2-40单克隆抗体应用组织微阵列、免疫组织化学技术（S-P法）检测了胆囊癌、癌旁组织和正常胆囊中LMVD的表达情况，并尝试探讨LMVD与胆囊癌生物学行为的相关性及临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

组织芯片为我科室构建保存。该芯片（图1）含有59例胆囊癌术后标本，其中男21例，女38例。60岁以下21例，60岁及60岁以上38例，平均年龄63.7岁。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。腺癌54例，腺鳞癌4例，未分化癌1例，其中淋巴结转移27例，肝脏侵犯13例。临床分期采用胆囊癌Nevin分期（1976），其中Ⅰ期5例（8.5%），Ⅱ期8例（13.6%），Ⅲ期21例（35.6%），Ⅳ期7例，（11.9%），V期18例（30.5%）。另取6例正常胆囊组织标本（上海第二军医大学尸检标本）作对照。

图1 胆囊癌组织芯片

1.2 免疫组织化学检测

1.2.1 抗体来源 鼠抗人D2-40单克隆抗体（即用型）及S-P免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。免疫组化技术采用S-P法，PBS替代一抗作阴性对照。1.2.2 结果判断 D2-40抗体标记的淋巴管判断标准：棕黄色的内皮细胞形成的条状管腔或隙状管腔，以胞质或胞膜呈清晰棕黄色颗粒为阳性表达。先在低倍镜（×40或×100）下扫描胆囊癌肿瘤周边区（即肿瘤组织与正常组织交接的区域）、肿瘤中心区，选择其中高淋巴管密度区，然后在高倍镜（× 400）下计数被D2-40抗体染成棕色的淋巴管数目，每个染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇，只要与邻近脉管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，即视为一个淋巴管。结果以5个高倍视野下的淋巴管均数表示。分别测定胆囊癌肿瘤中心区、周边区以及正常胆囊组织的LMVD。

1.3 统计学方法

所有结果均在SPSS 13.0统计软件包上进行处理，计量资料数据用±s表示，两个样本均数之间的比较采用t检验，3个样本均数之间的比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆囊癌中D2-40的表达

D2-40的阳性表达主要定位于淋巴管内皮细胞胞质或胞膜，为棕黄色颗粒，淋巴管形态呈管状或裂隙状，周边区淋巴管数量较多，而中心区数量较少。见图1。

胆囊癌周组织LMVD为8.91～16.35个，平均为（13.38±2.45）个；中心区LMVD为2.41～7.30个，平均为（4.90±1.90）个；正常组织LMVD为1.92～3.67个，平均为（2.70±0.83）个。癌周边区LMVD明显高于中心区和正常组织，差异有统计学意义（t＝22.881，P＜0.01；t＝8.130，P＜0.01）。

图1 胆囊癌周边区及中心区免疫组化结果（S-P法×100）

2.2 胆囊癌LMVD与临床病理参素间的关系

胆囊癌周边区LMVD与肿瘤的临床分期和淋巴结转移相关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肝脏侵犯均无关（P＞0.05），见表1。

表1 胆囊癌组织中LMVD的阳性表达与临床病理参数的关系

3 讨论

肿瘤的形成与生长是一个多因素、多步骤的过程［7］，其中肿瘤诱导的肿瘤相关淋巴管生成与肿瘤的生长、侵袭和转移能力密切相关［8］。肿瘤组织内新生的肿瘤相关淋巴管仅由单层细胞组成，无基底层结构，并且内皮细胞间的紧密连接少，存在较多腔隙，这些因素都有利于肿瘤细胞的淋巴管转移。而由于淋巴管特异性标志物的缺乏，对肿瘤淋巴管的研究一直存在争议，并因为缺乏基础理论的支持，临床上对大范围淋巴结清扫的价值一直存在争论。

D2-40是新近发现的一种相对分子质量为40 000的淋巴管内皮细胞标志物，大量研究表明其作为淋巴管内皮细胞的一种特异性标志物可用于识别正常和肿瘤组织中的淋巴管。D2-40可与癌胚抗原M2A特异性结合，M2A表达于淋巴管内皮细胞而不表达于血管内皮，因此D2-40被广泛应用于肿瘤淋巴管与肿瘤生物学关系的研究，是目前相对较好的淋巴管内皮细胞标志物［9－10］。Choi等［11］通过RT-PCR和免疫组化技术对29例乳腺癌标本用D2-40作淋巴管密度检测，发现癌组织中淋巴管密度不仅与淋巴结转移程度有关，而且可以用来估计肿瘤的转移及患者预后情况。Cao等［12］用D2-40对1 072例胃癌标本作免疫组化检测，结果显示LVI是胃瘤发生淋巴结转移的重要步骤，LVI与胃癌的淋巴结转移情况相关，N分期越高，LVI发生率也升高。

本研究中，D2-40染色阳性的微淋巴管显示清晰，与周围背景色对比良好，充分表明D2-40标记淋巴管特异性强，能够很好区别微血管与微淋巴管，可作为临床病理上鉴别胆囊癌微淋巴管的可靠标志物。本研究通过对59例胆囊癌癌周及癌中心组织和6例正常胆囊组织微淋巴管的标记和计数发现，胆囊癌周边组织中LMVD的表达明显高于癌中心组织（P＜0.01），可能反映了癌细胞向周围侵袭的生物学特性以及淋巴管在该过程的重要性；本研究结果显示LMVD与淋巴结转移情况及Nevin分期相关，N分期越高，LMVD发生率也升高，说明LMVD与胆囊癌进展、转移及侵袭潜力有密切关系，LMVD可能是反映胆囊癌预后的重要客观指标。本研究显示，胆囊癌周边区淋巴管呈不规则形扩张，而在胆囊癌中心区淋巴管数量明显减少，仅有少数淋巴管呈不规则状扩张，明显不及肿瘤周边微淋巴管数量多。胆囊癌周边区LMVD明显高于中心区和正常组织，该现象可能提示胆囊癌中淋巴管的形成主要位于周边区，并且是有功能的，中心区淋巴管则大多数为无功能的，不过具体机制有待进一步研究。

总之，本研究应用D2-40标记淋巴管内皮，对胆囊癌、癌旁组织和正常胆囊中D2-40的不同表达作相关分析，证明LMVD与胆囊癌淋巴结转移及Nevin分期相关，N分期越高，LMVD密度也高。本文再一次佐证了临床上根据胆囊癌Nevin分期的不同选择不同的淋巴结清扫范围（Ⅰ期单纯胆囊切除、Ⅱ期采用根治手术，Ⅲ、Ⅳ期根据肿瘤侵犯不同的部位或器官采取不同的扩大根治术）有一定的科学性。但本研究病例数较少，相关随访资料正在完善中，对LMVD与胆囊癌关系的研究尚不深入，仍需开展更进一步及更大规模的研究以证明LMVD在胆囊癌研究中的临床意义及判断预后的价值。

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R735.8

B

1671－7783（2014）02－0169－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y130270

*：通讯作者，主任医师，硕士生导师，E-mail：dinghouzhong＠163.com

2013－12－05 ［编辑］ 何承志