超微粉碎对罗勒显微特征及总黄酮体外溶出的影响

张海英，刘 飞

(新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐 830000)

罗勒(OcimumbasilicumL.)为唇形科植物罗勒的干燥地上部分，一年生草本，全国各地多有栽培。罗勒具有开窍、苏醒、发汗、祛风散肿和祛痰功能，用于心悸失眠、咳嗽哮喘、脾胃湿寒、口腔炎、尿路结石等[1]。罗勒全草主要含黄酮和香豆素等成分[2]。超微粉碎是指利用机械或流体力学的途径将物料粉碎至粒径<10 μm颗粒的过程。超微粉是超微粉碎的最终产品，具有一般颗粒所不具有的一些特殊理化性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等，目前在中药加工方面开始研究和应用，并显露出其特有的优势。本课题对罗勒超微粉与常规粉中总黄酮的体外溶出特性进行研究，为超微粉在中药生产中的应用提供实验数据和参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器 SYFM-8超微粉碎振动磨(济南松岳机器有限责任公司)；DYQ-188流水式粉碎机(中国浙江省瑞安市环球药械厂)；Rcz-6B3型药物溶出度仪(上海黄海药检仪器有限公司)；Cintra-20型紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；SK3300LH超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Leica DFC425IQ 光学显微镜(德国徕卡仪器有限公司)；AG-135万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品和试剂 芦丁对照品(纯度98%，批号100080-200707，中国食品药品检定研究院)；罗勒(批号 20121025，购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院)，经新疆医科大学附属中医医院李永和主任中药师鉴定为OcimumbacilicumL.。乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠等均为分析纯。人工胃液(按《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅩA方法自配)。

2 方法和结果

2.1 样品制备 (1)罗勒常规粉：罗勒药材剪成3 cm短段，经DYQ-188流水式粉碎机粉碎15 min，过100目筛，即得。(2)罗勒超微粉：罗勒药材剪成3 cm短段，经SYFM-8超微粉碎振动磨粉碎15 min制备而成。

2.3 方法学考察

2.3.1 最大吸收波长的选择 精密量取供试品溶液、芦丁对照品储备液各2 ml，分别置25 ml量瓶中，加60%乙醇溶液4 ml，总量为6 ml。各加4%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液各1 ml，摇匀，放置6 min，再各加10%氢氧化钠溶液10 ml，用60%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，在紫外-可见分光光度计下400～700 nm处扫描，确定最大吸收波长为(500±2) nm。

2.3.2 标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品储备液1、2、3、4、5、6 ml，置25 ml量瓶中，依次加60%乙醇溶液5、4、3、2、1、0 ml，使总量至6 ml。往下按2.3.1项下方法操作，得浓度为8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0 μg/ml的系列对照品溶液，以相应的试剂为空白，按照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅤA紫外-可见分光光度法，在500 nm处测定吸光度(Y)，以浓度(X)为横坐标，Y为纵坐标进行线性回归。回归方程为Y=12.814X+0.004 5(r=0.999 8)，结果表明芦丁在8.0～48.0 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.3.3 稳定性实验 精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml容量瓶中，其余操作同2.3.1项下方法。每隔15 min测定一次吸光度，测定至2 h。计算得到RSD为1.05%(n=9)，表明供试品溶液在2 h内稳定。

2.3.4 精密度实验 精密吸取芦丁对照品溶液(32.0 μg/ml)2 ml，置25 ml量瓶中，按2.3.1项下方法操作。重复测定6次，计算RSD为0.61%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重现性实验 称取同一批号(批号20120815)样品5份，按溶出量测定方法平行操作，测定吸光度，计算得到RSD为1.58%(n=5)。

2.4 统计学处理 组间比较采用t检验。

2.5 罗勒超微粉和常规粉体外溶出的研究[3，4]

2) 常规参数检查、运行组态、零点调整等操作，只能通过手抄器或专用软件到现场挂接操作，耗时耗力，效率低。

2.5.1 总黄酮溶出量的测定 分别取约7 g罗勒超微粉及常规粉各5份，精密称定，置半透膜中，加900 ml人工胃液(不加胃蛋白酶)作为溶出介质，余同2.2项之(2)。溶出3 h后，取样5 ml，立即补入(37±0.5) ℃人工胃液5 ml。样品液加60%乙醇溶液5 ml，超声30 min，用滤纸过滤。精密量取滤液2 ml，按2.3.1项下方法操作。测定总黄酮含量，计算最大溶出量。结果罗勒超微粉及常规粉的溶出量分别为(9.401±0.323)和(8.618±0.291) mg/g(n=5)。经t检验后，可知两种粉体中总黄酮体外溶出量无显著性差异(P>0.05)。

2.5.2 总黄酮溶出速率的测定 分别取约7 g罗勒超微粉及常规粉各3份，精密称定，余同2.2项之(2)，在1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60 min取样5 ml，立即补入(37±0.5) ℃人工胃液5 ml。样品加60%乙醇溶液5 ml，超声30 min，过滤。精密量取滤液2 ml，置25 ml量瓶中，按2.3.1项下操作。测定吸光度，计算各时间点总黄酮的累积溶出百分率，并绘制溶出曲线，结果见表1。

表1 罗勒超微粉体及常规粉体中总黄酮累积溶出百分率

Table 1 Cumulative dissolution percentage of ultramicro- and traditional powder forms of Ocimum bacilicum

表1 罗勒超微粉体及常规粉体中总黄酮累积溶出百分率

(t/min)1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 50 6041．2±1．250．9±1．855．8±1．962．2±2．164．9±2．371．2±2．175．0±1．980．2±2．483．8±2．688．2±2．190．3±2．992．5±3．152．3±1．563．4±1．977．0±2．184．5±2．287．1±2．391．3±2．494．3±2．195．4±3．196．5±3．297．5±3．098．7±2．999．1±3．4

2.5.3 总黄酮溶出曲线的拟合 数据按零级动力学函数、对数正态函数、Higuchi分布、Weibull分布曲线进行拟合，结果见表2。由表2可知，零级动力学模型、Higuchi模型的γ值比较低，对数正态分布和Weibull分布的γ值比较高，表明其相关性比较好，因此罗勒超微粉及常规粉总黄酮溶出曲线符合对数正态分布和Weibull分布。

2.5.4 溶出速率的比较 根据对数正态分布和Weibull分布计算T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9、m等溶出参数，T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9分别表示溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需的时间，m表示所拟合的直线的斜率，见表3。结果发现，超微粉和常规粉中总黄酮的溶出参数T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9上限和下限之间均无重复，说明差异具有统计学意义，经t检验，可见超微粉与常规粉中总黄酮溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需的时间均具有显著性差异(P<0.01)。

表3 罗勒超微粉和常规粉中总黄酮溶出参数

Table 3 Dissolution parameters of total flavone in ultramicro and traditional powder of Ocimum bacilicum

表3 罗勒超微粉和常规粉中总黄酮溶出参数

WeibullT0．50．289 1．778＊＊0．569 1．893＊＊Td1．051 5．241＊＊1．370 5．134＊＊T0．72．046 9．149＊＊2．142 8．522＊＊T0．85．447 20．755＊＊4．302 18．795＊＊T0．914．502 47．086＊＊10．170 49．877＊＊m 0．235 0．281 0．416 0．367

**P<0.01,与超微粉比较；T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9：溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需时间；m：所拟合直线的斜率

2.6 粉体的显微特征观察 分别挑取罗勒常规粉和超微粉少许，置载玻片上，水合氯醛加热透化，稀甘油固定后置显微镜下，进行光学显微观察、测量和摄影。显微鉴别结果表明，两种粉体的显微特征在同样放大倍数下有很大差异。常规粉在显微镜下能明显观察到非腺毛众多；导管螺纹；油细胞三角形或圆形，内含浅黄色油滴；而超微粉在镜下已不能见到完整的组织细胞，表现为不规则的小颗粒状物充满视野，呈淡黄色，有散在油滴，偶见螺纹导管碎片和非腺毛碎片。见图1。

图1 罗勒常规粉与超微粉显微特征图(×70)

2.7 粉体学特征研究[5](1)堆密度的测定：将罗勒粉末放入干燥的量筒中，轻轻振动，其近刻度处的体积V(ml)，与其质量m(g)的比值m/V即为堆密度。测定结果常规粉和超微粉的堆密度分别为(0.557±0.003)和(0.401±0.002) g/ml (n=3)。(2)休止角的测定：采用固定漏斗法，将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上方3 cm处，小心地将粉末沿最上的漏斗壁倒入，粉末顺次经过3个漏斗，自然流下，直到坐标纸上形成的粉末圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(2R)，计算出休止角tgθ=H/R(H=3 cm)。结果常规粉和超微粉的休止角分别为(42.6±0.7)°和(46.1±0.9)°，可见罗勒粉体流动性随着粒度减小而变差，微粉化对罗勒粉的流动性和填充性有不利的影响。

3 讨 论

黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于植物中，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤以及增强免疫力等药理作用。文献[6]表明，罗勒总黄酮具有清除超氧阴离子，抑制脂质过氧化，减轻或消除氧自由基对DNA损伤的作用，是有效的天然抗氧剂和自由基清除剂；还有抑菌活性。因此本研究选择总黄酮为评价指标。

体外溶出实验显示，在3 h内，罗勒超微粉的溶出量大于常规粉，但两者没有显著性差异，即在该条件下超微粉和常规粉中罗勒总黄酮均能充分溶出。但超微粉中总黄酮的体外溶出参数T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9均明显小于其常规粉，表明超微粉技术能显著加快罗勒总黄酮在水中的溶出速率。

一般情况下药用有效成分主要存在于细胞内，植物药细胞中的有效成分需经过浸润、溶胀、渗透和分散方能溶出。为消除这种阻力，本研究采用超微粉碎工艺。显微鉴别结果表明，罗勒常规粉碎后，粉末中的组织块清晰可见，且形状不规则；而经超微粉碎后细胞破壁率明显提高，显微镜下看不到完整的细胞组织，多为不规则的小颗粒状物，且大小均匀，颗粒的球性度提高。提示在制剂过程中，超微粉更加有利于制剂的混合均匀性。

文献报道粉体休止角θ<30°时流动性很好，θ≤40°时可以满足生产过程中流动性的需求，θ>45°时流动性差。本研究中测得罗勒经过超微粉碎后粉体休止角为46.1°，说明其流动性不好。堆密度是反映粉体充填性的指标之一，在片剂、胶囊剂的装填过程中具有重要意义。堆密度大，有利于粉末的充填。本研究结果表明罗勒超微粉碎后堆密度较常规粉减小，表明其流动性和充填性变差。提示在制剂的过程中，可采用加助流剂或制颗粒的方法加以改善。

综上所述，超微粉具有速释的特点，有效成分溶出速率和溶出量增大。 但药物的粒径和溶出速率之间的相关性， 尚需深入研究。 超微粉碎过程会使某些活性成分溶出速率提高， 是否也会让某些具有毒性作用的化学成分溶出速率提高也需进行深入研究。

【参考文献】

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[2] 尹 锋,胡立宏,楼风昌.罗勒化学成分的研究[J].中国天然药物,2004,2(1):20-24.

Yin Feng, Hu LiHong,Lou FengChang. Studies on the chemical components ofOcimumbasilicumL.[J].Chin J Nat Med,2004,2(1):20-24. In Chinese with English abstract.

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Zhang ChunFeng,Li Kai,Yang ZhongLin.Comparison of dissolution of asperosapon Ⅵ between ultra-micro powder and fine powder of Radix Dipsaci[J].Chin Tradit Pat Med, 2010,32(1): 100-102. In Chinese with English abstract.

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Sun Qiang, He Ying.Pharmaceutical characteristics of Angelica Sinensis micropowder[J]. China Pharmacy,2007,18(15):1141-1143. In Chinese with English abstract.

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