自动固相萃取－液相色谱－飞行时间质谱法快速筛查与确证血液中抗抑郁类药物

石银涛， 郭璟琦， 王绘军， 段 杰， 喻洪江， 郑 经， 王俊伟＊

（1.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆400021；2.重庆警察学院禁毒系，重庆401331）

抑郁症是一种常见的精神疾病。目前中国的抑郁症患者已超过2 600万，在自杀和自杀未遂人群中，抑郁症患者占了50%～70%［1］。近年来，大学生患抑郁症的比例高达3%～5%，已经成为不可忽视的社会问题［2］，且在逐年递增的大学生自杀案例中，有60%都与抑郁症或精神分裂症等精神疾病有关。目前，抑郁症尚无法根治，最基本、最重要、见效最快的方法就是进行药物治疗。

抗抑郁类药物因具有抑制躁狂、抗焦虑和抗惊厥等作用而被越来越广泛地应用于抑郁症治疗。但滥用、误用该类药物或利用此类药物投毒迷奸的事（案）件时有报道。因此，法庭科学和毒物检测领域对抗抑郁类药物的检测要求也日益增高［3］。

目前，抗抑郁类药物的检测方法主要有气相色谱法（GC）［4］、高效液相色谱法（HPLC）［5］、气相色谱－质谱联用法（GC－MS）［6－10］、液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）［11－17］。GC和LC对样品前处理要求严格，样品中的基质干扰使检测容易出现假阳性，无法进行准确的定性分析，不能作为最终的确认方法。由于抗抑郁类药物不易挥发，GC－MS方法检出限高、灵敏度较低，且不适合做定量分析。基于多反应监测模式的LC－MS／MS因具有特异性强、灵敏度高、重现性好、线性动态范围宽等特点，在抗抑郁类药物检验中应用广泛；但是该方法建立的过程复杂、耗时长，检测的目标物数量有限，且不能提供精确质量数，在痕量多组分的定性分析和快速筛查中存在不足。以四极杆／飞行时间质谱（Q－TOF／MS）为代表的高分辨质谱技术在其扫描质量范围内可提供目标物的精确质量数，且具有质量分辨率高、分析物数量不受限制、选择性高、基质干扰小、方法建立过程简单以及数据库检索方便等优点，因此在复杂基质的目标物分析中有着广泛的应用前景［18－22］。LC－Q－TOF／MS不仅可以获得目标物的分子离子信息，还可以在碰撞碎裂后获得丰富的碎片离子信息。这些碎片离子的精确质量信息使其定性确证能力更强［23］。

常用的样品前处理方法有液液萃取和固相萃取。液液萃取操作繁琐、需要大量的有机溶剂，且重现性差。固相萃取具有有机溶剂使用量少、选择性强、分离时间短、净化效果好等优势，能显著提高血液中抗抑郁类药物的提取回收率。另外，固相萃取可实现自动化，不但能够节省时间和人力成本，并且具有重现性好的特点。

本文将自动固相萃取技术和LC－Q－TOF／MS结合，通过Q－TOF／MS的target MS／MS功能获取二级质谱对目标物进行定性分析，同时通过对LCQ－TOF／MS总离子流图中目标物进行精确质量数窗口（＜2×10－5Da）的提取，利用提取离子流峰面积进行定量分析。因此通过精确质量数、保留时间、同位素丰度、同位素间距、碎片离子等进行数据库检索比对，能够在一次分析中完成高选择性的定性分析和高灵敏度的定量分析，可以方便快速地对血液中卡马西平（carbamazepine）、多虑平（doxepin）、氯氮平（clozapine）、阿米替林（amitriptyline）和米氮平（mirtazapine）等抗抑郁类药物实现筛查与确证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290－6550超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱仪，配有Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization（Dual AJS ESI）源（美国 Agilent公司）；固相萃取仪 GX－274（美国 Gilson公司），AE240电子天平（精度为万分之一，瑞士 Mettler Toledo公司）、Allegra X－22R Centrifuge型冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）、Millipore Direct－Q3型纯水机（美国Millipore公司）等。

HLB固相萃取柱（60 mg／3 mL，美国 Waters公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），其他试剂均为分析纯。

卡马西平、多虑平、氯氮平、阿米替林和米氮平标准品，纯度均≥98.0%，均购自美国Sigma公司。结构式见图1所示。

准确称取10 mg标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后摇匀，贮备液于－18℃下保存，使用时根据需要用甲醇稀释配制成不同浓度的单标准工作液和混合标准工作液。

图1 5种抗抑郁类药物的结构式Fig.1 Structures of the five antidepressants

1.2 样品前处理

取1 mL血液于15 mL具塞离心管中，加2 mL去离子水稀释，用饱和Na2CO3溶液调节pH为9，涡旋混匀，待净化。

固相萃取：将待净化液以9 500 r／min速率离心5 min，取上清液待过柱。将HLB固相萃取柱依次加3 mL甲醇、3 mL去离子水活化。将上清液过柱，用3 mL去离子水淋洗，用3 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干；加入1 mL流动相溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜，滤液供LC－Q－TOF／MS分析。

液液提取：待净化液中加入3 mL乙醚，涡旋振荡，混匀后超声5 min，以9 500 r／min速率离心5 min，取上清液；重复提取1次；合并上清液，用氮气吹干；加入1 mL流动相溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，滤液供LC－Q－TOF／MS分析。

1.3 液相色谱条件

Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）及Extend C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）（美国Agilent公司）；柱温35℃；进样量2μL。流动相为甲醇（A）和0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸铵）（B），流速0.3 mL／min；梯度洗脱程序：0～2 min，80%B；2～7 min，80%B～5%B；7～9 min，5%B；9～9.1 min，5%B～80%B；9.1～12 min，80%B。

1.4 Q－TOF／MS质谱条件

离子源：Dual AJS ESI源；扫描方式：正离子全扫描；全扫描范围：50～1 000 Da；毛细管电压：4 000 V；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12.0 L／min；干燥气流速：16.0 L／min；干燥气温度：200℃；碎裂电压：135 V。参比溶液中含嘌呤（C5H4N4，离子精确质 量 数 为 121.050 873）和 HP－0921（C18H18O6N3P3F24，其离子精确质量数为922.009 798）。

数据采集、定性处理和定量处理分别经过Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition、Agilent MassHunter Qualitive Analysis（B.06.00）和Agilent MassHunter Quantitative Analysis软件完成，抗抑郁类药物数据库通过Agilent MassHunter PCDL Manager建立。

2 结果与讨论

2.1 LC－Q－TOF／MS分离条件的选择

考察了Eclipse Plus C18色谱柱和Extend C18色谱柱对抗抑郁类药物的分离效果。结果表明，Extend C18色谱柱分离效果差，峰重合较多；而使用Eclips Plus C18色谱柱时，目标物分离较好，且峰形对称，这主要是因为该柱对碱性化合物具有较高的分离度和出色的峰形。

实验中比较了0.2%甲酸水溶液－甲醇、0.2%甲酸水溶液－乙腈、0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸铵）－甲醇和0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸铵）－乙腈4种流动相体系对分离效果的影响。选用甲醇作为有机相时峰形较好且分离效果较佳。在水相中添加5 mmol／L甲酸铵可以抑制抗抑郁类药物在离子源中生成［M＋Na］＋峰，虽然背景值有所升高，但目标物的信号显著增强，从而提高了检测的灵敏度和稳定性。因此，本研究选用0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸铵）－甲醇体系作为流动相，并在此基础上优化了流动相梯度洗脱条件。梯度起始时选用80%B有利于洗脱血液中的极性基质，减少样品中目标物电离时的基质干扰。目标物的色谱图如图2所示，在流动相梯度洗脱条件下，目标物分离较好且峰形对称，能够满足质谱检测的要求。

2.2 样品前处理条件的选择

2.2.1 前处理方式的选择

本研究比较了固相萃取和液液提取对血液样品中目标物提取回收率的影响。由表1可见，固相萃取相对液液提取的回收率更高，稳定性和重现性好。同时，固相萃取分离纯化效果更好，杂质干扰少。

图2 5种抗抑郁类药物标准溶液（100μg／L）的色谱图Fig.2 Chromatograms of a mixed solution of the five antidepressants（100μg／L）

表1 血液中5种抗抑郁类药物的液液提取和固相萃取的回收率（n＝6）Table 1 Extraction recoveries of the five antidepressants spiked in blood cleaned up by liquid－liquid extraction（LLE）and solid phase extraction（SPE）（n＝6）

2.2.2 样品pH 的选择

本实验考察了样品的pH对固相萃取回收率的影响。样品的pH分别为3、5、7、9和11时的回收率见图3。在pH为9和11时固相萃取回收率相差较小，且明显高于酸性条件下的回收率，考虑到碱性太强时目标物容易分解，且血液容易凝固，不利于目标物的提取，因此选择样品的pH为9。

2.3 基质效应的影响

图3 血液中5种抗抑郁类药物在不同pH时的固相萃取回收率Fig.3 Extraction recoveries of the five antidepressants in blood extracted by SPE under different pH conditions

基质效应是指基质中的共提取干扰物影响目标物的离子化，从而使目标物的响应发生增强或抑制。因此，需要对目标物在不同基质中的基质效应进行评价，并根据评价结果选择适合的方法抵消基质效应产生的偏差［24］。本研究中采用空白样品基质提取液添加标准溶液后的色谱峰面积除以标准品溶液的色谱峰面积得到的比值评价基质效应（Matrix effect）。选择10、100、500μg／L 3个添加水平，按照1.2节中固相萃取方法测定6次。结果（见表2）表明目标物的基质抑制效应程度均较大，为了保证结果的准确性，在没有目标物对应内标的情况下，必须使用基质匹配外标校准曲线才能对血液中的目标物进行准确的定量分析。

表2 血液中5种抗抑郁类药物的基质效应（n＝6）Table 2 Matrix effects of the five antidepressants in blood（n＝6）

2.4 方法评价

2.4.1 线性方程及检出限

在优化条件下，采用基质匹配外标标准曲线计算，考察了目标物在1～500μg／L范围内的线性关系和相关系数。以定量离子的峰面积对质量浓度绘制标准曲线，结果见表3。在1～500μg／L范围内，各目标物均呈良好的线性关系，相关系数为0.997 6～0.999 7。

表3 5种抗抑郁类药物的线性方程、相关系数及检出限Table 3 Regression equations，correlation coefficients（r）and limits of detection （LODs）of the five antidepressants

2.4.2 回收率和精密度

取空白血分别加入10、100、500μg／L的混合标准溶液，按1.2节中固相萃取处理后的色谱峰面积除以空白样品基质提取液添加相应的混合标准溶液后的色谱峰面积的比值计算回收率。每个添加浓度水平重复测定6次，计算回收率和精密度（RSD）。由表4可见，目标物的平均回收率在79.6%～96.4%之间，精密度范围为4.1%～6.4%。

表4 血液中5种抗抑郁类药物的加标回收率和精密度（n＝6）Table 4 Mean recoveries and RSDs of the five antidepressants spiked in blood（n＝6）

2.4.3 数据库的建立及筛查

利用Agilent MassHunter PCDL Manager软件建立目标物数据库。该数据库包括目标物的名称、分子式、精确质量数、保留时间和目标物所有碎片离子信息。通过目标物的精确质量数、同位素丰度比、同位素间距和保留时间对血液中抗抑郁类药物进行初筛，通过实际测定样品的谱图与谱库中碎片离子信息的镜像比对对抗抑郁类药物进行定性确认。

利用建立的数据库对某加标样品进行测试，通过软件自动比对实测样品和数据库中目标物的保留时间、精确质量数、同位素分布以及碎片离子信息匹配度等信息进行快速准确筛查，结果见表5。在所设定的严格筛查条件下，所添加的抗抑郁类药物能够全部被检测出来，且保留时间偏差全部小于0.1 min，质量偏差小于1 mDa，MS匹配得分、同位素丰度匹配得分和同位素间距得分均大于95；卡马西平、米氮平、阿米替林和多虑平的MS／MS匹配得分均大于70，但氯氮平的二级图谱匹配得分只有53.13，不能达到70分的确认标准［24］。这主要是因为干扰离子m／z 270.079 2响应太高，导致同位素峰m／z 271、272匹配较差，因此得分偏低。

在氯氮平数据处理过程中对干扰离子m／z 270.079 2进行手动背景扣除，得分可达到90.97，由图4可以明显看出，采用背景扣除提高了碎片离子的匹配度，进而大大提高了MS／MS匹配得分，因此认为氯氮平被检出并得到了确认。

2.5 实际样品分析

利用本研究建立的LC－Q－TOF／MS抗抑郁类药物数据库快速筛查确证技术对实验室一起毒化案件样品进行检验。2014年2月，重庆某区居民张某在宾馆被麻醉强奸，于第二日早上在宾馆发现颗粒状固体，提取张某静脉血和颗粒状固体进行检验，在血液中筛查出阿米替林、卡马西平和多虑平，同时在颗粒状固体中检出卡马西平和多虑平。

表5 利用Agilent MassHunter PCDL Manager软件对加标样品中5种抗抑郁类药物的筛查结果Table 5 Screening results of the five antidepressants spiked in blood using Agilent MassHunter PCDL Manager software

图4 血液样品中氯氮平（a）扣除背景前和（b）扣除背景后碎片离子镜像信息的对比图Fig.4 Spectral difference（a）before and（b）after background subtraction of clozapine in blood

采用基质匹配外标标准曲线对筛查出的抗抑郁类药物进行定量，结果血液中阿米替林、卡马西平和多虑平的质量浓度分别为296.6、189.6和102.3 μg／L。该结论为案件性质的判定提供了重要依据。

3 结论

本文采用自动固相萃取方法对血液样品进行前处理，并建立了目标物数据库。利用LC－Q－TOF／MS数据库检索进行定性分析，利用基质匹配外标标准曲线法进行定量分析，实现了对实际样品中抗抑郁类药物的筛查、确证与定量，并取得了令人满意的结果。该方法具有前处理简单、分析速度快、灵敏度高、重现性好的优点，在法庭科学和医学检验中具有重要的实际意义。

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