人参总皂苷的发酵及其产物的抗癌活性研究

崔磊，金护定，尹成日

(延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉 133002)

0 引言

人参皂苷(ginsenosides GS)是人参生理活性的主要物质基础，也是人参成分中最有效的药用成分.目前，已经从人参中分离出约50种人参皂苷成分[1].药理研究表明，人参皂苷普遍具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、改善记忆力[4]、抗疲劳[5]、保护神经[6]等药理作用.人参皂苷Rg3最初从红参中分离得到[7]，它主要作用于细胞增殖周期的G2/M期，具有诱导肿瘤细胞凋亡，选择性抑制肿瘤细胞黏附和浸润，抑制肿瘤新生血管的形成，增强机体免疫力等作用；但这些皂苷天然含量极低，如Rg3在白参中的含量仅为0.000 3%，在红参中的含量约为0.03%，因此从人参中直接提取这些稀有皂苷较为困难.

目前，制备人参皂苷主要采用在人参中对含量较高的Rb1、Rb2、Rc、Rd等主皂苷(major ginsenosides)分子的糖基进行选择性水解的方法，其中微生物转化法具有条件温和、选择性强、无污染等优点[8].侯耀达等[9]利用从林下参根部土壤中分离得到的菌株GS1-33将人参根总皂苷转化为人参稀有皂苷C-K和Rh1.白龙律等[10]利用一种扩展青霉(Penicilliumexpansum)GY-06将人参皂苷Rb1转化为Rg3.本文利用从土壤中优选的人参皂苷生物转化高效菌株，对人参茎叶总皂苷及人参提取物进行微生物转化，并考察了其人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞的抑制作用.

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品采集于长白山园参、移山参根部土壤以及长白山温泉土样.

1.2 试剂

人参茎叶总皂苷和人参皂苷购于成都思科华生物技术有限公司，人参购于延吉市参茸市场，薄层层析板Silica gel 60-F254购于德国Merck公司，营养琼脂、R2A琼脂、YM琼脂和MRS琼脂培养基购于Sigma公司，实验中所用化学试剂均为分析纯.

1.3 仪器

仪器有：立式电热压力蒸汽灭菌器(LDZX- 30KB，上海申安医疗器械)；生物安全柜(BSC-1300 Ⅱ A/B3)；pH计(雷磁PHS-3C型)；电子天平(JA5003型，上海良平仪器仪表有限公司)；高速离心机(MCD-2000 HSIANGTAI)；液相色谱仪(LC-6A，日本岛津)；振荡培养箱(HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；分析天平(Sartorius BT 224 S)；ALT试剂盒、AST试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)；SP-4430全制动生化分析仪(日本ARKRAY公司)；PCR仪(TC-512，英国Techne公司)；光学显微镜(BX61 Olymps Cooperation Made In Japan)；酶标仪(FLx 800，基因有限公司)；MALDI-TOF-MS (Voyager DE-STR，日本导津).

1.4 微生物的分离筛选

将采集的土样利用十倍稀释法进行稀释，将稀释液分别接种到营养琼脂、R2A、YM琼脂和MRS琼脂培养基上，在30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，随后挑取单个菌落传代；重复以上操作数次，得到纯培养的菌种[11].根据七叶苷显色原理[12]，七叶苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成葡萄糖和6,7-二羟香豆素(七叶苷元)，七叶苷元遇到铁离子生成黑色物质.把分离出的单一菌株涂在由七叶苷修饰的R2A琼脂(E-R2A)培养基上培养，琼脂培养基成分包括R2A琼脂15.2 g，七叶苷1.0 g，柠檬酸铁0.5 g.观察培养基的颜色变化，变成黑色的即为具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株，且颜色越黑，活性越强.

1.5 人参茎叶总皂苷的微生物转化

配制pH 7.0的液体培养基，加入10 g/L的人参茎叶总皂苷，然后分装在250 mL三角瓶中，每瓶50 mL；高压灭菌，冷却至室温后，接种5 mL产β-葡萄糖苷酶的菌株培养液，放置于30 ℃、150 r/min振荡培养器中发酵.每隔2 d取样品，连续取5次，离心后取上清液，然后用TLC和HPLC测定发酵过程中人参皂苷的变化.液体培养基成分为：NH4Cl (0.5 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，K2HPO4(1 g/L)，MgSO4·7H2O (0.25 g/L)，酵母膏(1 g/L).

1.6 人参提取物的微生物转化

取25 g鲜参(或5 g干参)加入250 mL蒸馏水，用保鲜膜密封后置于恒温培养箱中，24 h后过滤得到人参提取物.将提取物用1 mol/L HCl处理，得到酸处理后的人参提取物.然后，利用产β-葡萄糖苷酶菌株分别对人参提取物和酸处理后的人参提取物进行发酵，得到两种人参发酵物.

1.7 薄层色谱法(TLC法)测定人参皂苷

将人参稀有皂苷Rg3和Rh2的标准品配成混合标准品醇溶液.将样品与标准品溶液在TLC板上同时展开，展开剂为体积比为10∶5∶1的氯仿、甲醇、水混合液，吹干后用10%(体积比)的硫酸乙醇溶液显色，并与标准品Rf值比对，以此检验稀有人参皂苷Rg3和Rh2是否生成.

1.8 高效液相色谱法(HPLC法)测定人参皂苷

高效液相色谱仪HP 1100，UV检测器，色谱柱采用BDS HYPERSIL C18柱 (250 mm×4.6 mm)，检测波长为203 nm，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，流动相为0.001%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱(条件如表1).

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

1.9 人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞的抑制作用

选取菌株YS2、YS5、YS7和YS8对人参提取物和酸处理后的人参提取物进行发酵转化，发酵8 d后，将发酵液离心，灭菌，冻干成粉末得到人参发酵物.取对数生长期细胞，消化后接种细胞于96孔板中，加入不同浓度的人参发酵物培养.加入噻唑蓝(MTT)溶液孵育后，用酶标仪测定吸光度，根据公式：细胞存活率/%=(实验孔测定值/对照孔测定值)×100,计算结肠癌colon26-M3.1细胞存活率[13]，并计算50%细胞存活率时的发酵物的浓度(IC50).

1.10 菌株的形态学观察及ITS测序

在光学显微镜下观察菌株YS2菌体的大小、形态及孢子形态.采用氯化苄法[14]提取YS2菌株基因组总DNA，使用nested-PCR扩增ITS序列[15].先用引物NSA3 (5′-AAA CTC TGT CGT GCT GGG GAT A-3′)和NLC2 (5′-GAG CTG CAT TCC CAA ACA ACT C-3′)进行PCR扩增.PCR反应体系(25 μL)为：2X Taq PCR MasterMix (TIANGEN) 12.5 μL，MgCl2(25 mΜ)1 μL，引物为NSA3 (5 μΜ)和NLC2 (5 μΜ)各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水8.5 μL.PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20个循环；72 ℃ 15 min.采用PCR纯化试剂盒(Bioneer公司)纯化PCR产物，送上海英骏生物技术有限公司进行测序.

将测得的基因序列通过Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)与GenBank中核酸数据库进行对比分析，相似的序列进行多重匹配排列分析(clustalx 1.83)[16].用Mega 4.0[17]分析软件中的Neighbor Joining方法[18]构建系统发育树.

2 结果与分析

2.1 微生物的分离与筛选

从采集的长白山土壤样品中共分离得到256种菌株，且筛选出102种产β-葡萄糖苷酶的菌株.在其中挑选出14种β-葡萄糖苷酶高产菌株(编号为YS1-YS14)进行人参茎叶总皂苷和人参提取物的微生物转化实验.

2.2 人参茎叶总皂苷和人参提取物中人参皂苷的含量分析

用HPLC分析人参茎叶总皂苷水溶液10 g/L，其主要成分及含量见表2.人参提取物中人参皂苷的含量见表3.由表3可知，鲜参和干参提取物中均含有较高含量的Rb1、Rb2和Rd，且干参中人参皂苷的含量比鲜参高.

表2 人参茎叶总皂苷中人参皂苷含量 μg/mL

表3 人参提取物中人参皂苷含量 μg/mL

2.3 人参茎叶总皂苷的微生物转化

在14种高产β-葡萄糖苷酶的菌株中，YS2、YS12、YS13和YS14菌株对人参茎叶总皂苷具有较好的转化作用，其中菌株YS2的转化效果最好.利用菌株YS2发酵人参茎叶总皂苷的产物为稀有人参皂苷Rg3 (图1)，并且发酵2 d后Rg3的产率达到最高值(见表4).利用MALDI-TOF-MS进一步确定发酵产物Rg3 (分子量785.02)，在负离子模式下，分子离子峰([M+35Cl]-=818.1)与同位素峰([M+37Cl]-=820.1)的峰高比值为3∶1，由此可知产物的分子量与Rg3吻合(见图2).

图1 菌株YS2发酵人参茎叶总皂苷的HPLC谱图:(A)为发酵前；(B)为发酵2 d后

表4 YS2对人参茎叶总皂苷的转化 μg/mL

图2 发酵产物的MALDI-TOF-MS谱图

2.4 人参提取物的微生物转化

本文对人参发酵采取了直接发酵和酸处理后发酵的两种方法.发酵前的人参提取物中主要含有人参皂苷Rb1、Rb2和Rd，未含有稀有人参皂苷Rg3和Rh2 (见表3).菌株YS2、YS5、YS7和YS8均能将人参中的Rb1、Rb2、Rd转化为稀有人参皂苷Rg3，其中菌株YS2的转化率最高，并且菌株YS2、YS7和YS8对酸处理后的人参显示出更高的转化率(见表5).

表5 人参发酵物中稀有人参皂苷的含量

2.5 人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞的抑制作用

IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低.菌株YS2、YS5、YS7和YS8的人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞均有较强的抑制作用，其IC50值如表6所示.从表6中可以看出：菌株YS2和YS7的人参发酵物(酸处理后发酵)对结肠癌colon26-M3.1细胞的IC50值分别为180 μg/mL和170 μg/mL，具有很强的抑制活性(文献值为730 μg/mL)[13]；其次是菌株YS8的人参发酵物(IC50值为220 μg/mL)；其余发酵产物的抑制作用相对弱一些.分析表明，人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞的抑制活性直接与人参发酵物中稀有人参皂苷Rg3的含量有关.

表6 人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞的抑制浓度(IC50) μg/mL

2.6 菌株YS2的形态学观察及其ITS测序鉴定

菌株YS2在PDA培养基上生长旺盛，呈丝状、白色(见图3).菌丝细长，分隔，分枝，淡色；分生孢子梗由菌丝顶端生成或从菌丝侧壁产生，直立，不分枝(见图4).

图3 YS2菌PDA培养基上的菌落

图4 YS2菌的分生孢子

菌株YS2的ITS序列如下：

>YS2_NLB4_1

CTCCTGGTCGTCTGGGATAAAGCATGCAATTATGCTTTCAACGAGGATGCCTAGTAAGCGCGTGTCATCAGCATGGTTTGATTACGTCCCTGACCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGCTGCTCGAGGAGGTTGGCAAGACCACCTCAAGCCGGAAAGTTCGTCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGGAAGCTTCTTTTTTTTCGAATTTGAAA.

菌株YS2的ITS序列测定和系统发育分析结果表明(图5)，该菌株归属于链格孢属(Alternaria).

图5 菌株YS2的无根系统发育树

3 结论

本文利用β-葡萄糖苷酶高产菌株将人参茎叶总皂苷和人参提取物中的人参皂苷转化为稀有人参皂苷Rg3，研究表明，经酸处理后的人参显示出更高的转化率.菌株YS2和YS7的人参发酵物对结肠癌colon26-M3.1细胞具有很强的抑制作用，其IC50值分别为180 μg/mL和170 μg/mL.经形态学观察和ITS序列分析，确定菌株YS2为链格孢属(Alternaria).本研究对利用微生物转化法提高人参的生物活性和制备抗肿瘤稀有人参皂苷均具有一定的意义.

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