“益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠免疫功能影响的实验研究

易清清 谭 莹 李 曰 杜 斌 冯 磊 邱丽颖 (江南大学药学院，无锡214122)

现今治疗肿瘤不仅注重治疗效果，同时更注重机体的反应性。对肿瘤及宿主双方面因素综合考虑，采用扶正与祛邪相结合，以增加和调动机体自身抗癌能力，是当前恶性肿瘤治疗的一种常用的方法［1］。中医药的抗肿瘤疗效显著，毒副作用小，对肿瘤患者免疫调节作用具有明显的优势［2］。中医药从调节免疫功能出发，配合化疗可起到增效减毒作用，并改善患者低下的免疫功能。中医治疗中晚期恶性肿瘤以扶正培本为主，也是中医治疗恶性肿瘤的最大特色，而最突出的就是提高患者免疫功能，改善临床症状和生存质量，提高生存率［3］。“益元抑瘤汤”是临床的经典验方，在无锡市中西医结合医院已经作为医院制剂进行临床治疗使用，对肿瘤病人作为辅助药物治疗效果显著。本研究观察“益元抑瘤汤”水煎液对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响，为阐明该方的临床应用效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 PRMI1640培养液(美国Gibco公司);脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(Con A)、甲基偶氮唑盐(MTT)、IL-2试剂盒、TNF-α 试剂盒、印度墨汁(北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(Sigma公司)。

1.2 受试药的制备 根据无锡市中西医结合医院制剂制备工艺，取“益元抑瘤汤”一个处方量:黄芪20 g、合欢皮15 g、灵芝10 g、茯苓20 g、女贞子10 g、浙贝母10 g。加水1 020 ml，浸泡30 min，加热煮沸两次，每次2 h，过滤，合并滤液。浓缩，干燥，粉碎后备用。于动物实验前用蒸馏水溶解成所需浓度。

1.3 动物模型的建立 H22小鼠肝癌细胞株(上海医药工业研究院药理学研究室)，动物腹腔内接种传代。腹腔接种H22腹水7 d的瘤源鼠脱颈处死，无菌抽取腹水，在显微镜下进行细胞计数，然后用生理盐水稀释，调整细胞数至2×107～3×107个/ml。取0.2 ml注入雌性ICR小鼠(上海斯莱克试验动物有限责任公司)右腋皮下［4］。将接种的小鼠随机分为三组，每组10只:肿瘤对照组，阳性参一胶囊(生产厂家:吉林亚泰制药股份有限公司，批号:20120502)组，“益元抑瘤汤”剂量组，另取未接种小鼠作为正常对照组。接种H22细胞后次日开始给药，连续灌胃给药14天，每日给药一次。每日给药前记录各组动物的体重、饮食、毛发、活动、精神状态等体征。

1.4 药物用量 正常对照组:生理盐水0.1 ml/10 g体重;肿瘤对照组:蒸馏水0.1 ml/10 g体重;阳性对照组:参一胶囊，按说明书由人换算成小鼠给药浓度为80 mg/ml/10 g体重;“益元抑瘤汤”组:医院临床用量为每日14.1 g，换算成小鼠给药浓度为181.8 mg/ml/10 g体重。

1.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的测定 给药14 d后，实体瘤小鼠摘眼球取血0.5～1 ml，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取血清置于 -20℃保存，IL-2、TNF-α试剂盒测定。

1.6 小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖的测定 给药14 d后，脱颈处死动物，75%酒精浸泡5 min，无菌取出脾脏，剪碎，再转入5 ml玻璃匀浆器中仔细研磨，过200目细胞筛并制成细胞悬液，用PBS洗涤，1 000 r/min离心10 min，重复两次。再用完全培养液调浓度为5×106个/ml。将调整好浓度的细胞悬液加入96孔细胞培养板(每孔100μl)，设3个重复。每只小鼠脾细胞悬浮液分为3组，一组加5μl(浓度为0.1 mg/ml)Con A 液，一组加10 μl(浓度为0.1 mg/ml)LPS液，一组不做处理。置37℃、5%CO2培养箱培养44 h，加入5 mg/ml的 MTT液10 μl，振摇，继续培养4 h后取出，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加DMSO(每孔100μl)，振荡，用酶标仪在波长550 nm处测OD值。淋巴细胞的增殖能力分别用加Con A和LPS孔的光密度值减去不加Con A和LPS孔的光密度值表示。

1.7 小鼠巨噬细胞功能的测定 末次给药后1 h，于鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(生理盐水稀释3倍)0.1 ml/10 g，注射后 2 min、10 min 分别从小鼠的左眼静脉丛和右眼静脉丛取血20μl，加入0.1%Na2CO3溶液 2.0 ml中，摇匀，以 0.1%Na2CO3溶液做空白对照。用酶标仪在波长600 nm下比色，测定其OD值。将小鼠称重，处死，取肝、脾称重，按下列公式计算出碳廓清指数κ和吞噬系数α:κ=(logOD1-logOD2)/(t1-t2);α =κ1/3×W/WLS，式中OD1、OD2分别为 2 min、10 min 时，取血测得的吸光度值，t1、t2为注射印度墨汁后采血的时间，W为体重，WLS为肝+脾合重。

1.8 统计学分析 所有实验数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计学软件进行数据统计，多组均数比较用单因素方差分析。P＜0.01认为有显著的统计学意义，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 给药期间各组动物一般情况 结果见表1。

2.2 “益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响 由表2可以看出，模型组和参一胶囊组的血清IL-2含量明显低于正常组，而“益元抑瘤汤”组的血清IL-2含量显著升高，与模型组比较具有显著的统计学差异(P＜0.01);模型组、参一胶囊组和“益元抑瘤汤”组的血清TNF-α含量均明显高于正常组，与模型组比较，参一胶囊组和“益元抑瘤汤”组差异有显著性(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 “益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖的影响 由表3可知，模型组的T、B细胞转化能力均低于正常组，参一胶囊阳性对照组和“益元抑瘤汤”组小鼠的T、B细胞转化能力均高于正常组，与模型组比较，参一胶囊组和“益元抑瘤汤”组差异均具有显著的统计学意义(P＜0.01)。

表1 “益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠体重、精神的影响Tab.1 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on weight and mental state in H 22 tumor-burdened mice

表2 “益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表2 “益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜ 0.01.

Group n IL-2(pg/ml) TNF-α(μg/ml)NC 10 82.71 ±13.01 1.12 ±0.13 MC 10 63.96 ±3.603) 1.45 ±0.173)Rg3 10 68.13 ±6.253) 1.67 ±0.231)3)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 80.62 ±12.502) 2.11 ±0.282)3)

表3 “益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖的影响± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表3 “益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖的影响± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜ 0.01;Compared with normal control，2)P ＜0.05.

Group n T lymphocytes(OD) B lymphocytes(OD)NC 10 0.191 ±0.040 0.192 ±0.060 MC 10 0.155 ±0.0252) 0.158 ±0.014 Rg3 10 0.230 ±0.0111)2) 0.230 ±0.0111)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.217 ±0.0111) 0.223 ±0.0121)

表4 “益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠巨噬细胞功能的影响± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

表4 “益元抑瘤汤”对H 22荷瘤小鼠巨噬细胞功能的影响± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜0.01.

Group n The carbon clearance index(κ)Predominate consume coefficient(α)NC 10 0.021 ±0.002 4.95 ±0.32 MC 10 0.027 ±0.0093) 4.89 ±0.18 Rg3 10 0.026 ±0.0063) 5.08 ±0.261)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.036 ±0.0091)3) 5.60 ±0.352)3)

2.4 “益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠巨噬细胞功能的影响 由表4可以看出，模型组、参一胶囊组和“益元抑瘤汤”组的碳廓清指数κ均显著高于正常组，与模型组比较，“益元抑瘤汤”组差异有显著性(P＜0.05);参一胶囊组和“益元抑瘤汤”组的吞噬系数α均高于正常组，并且与模型组的差异均具有统计学差异(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3 讨论

机体抗肿瘤的免疫机制十分复杂，抗肿瘤免疫效应一般以细胞免疫为主，但对病毒诱发的肿瘤，体液免疫亦起到十分重要的作用。肿瘤的存在不仅抑制机体的细胞免疫，同时也抑制体液免疫。因此，提高肿瘤患者的免疫功能，成为抗肿瘤治疗的一个主要方面［5］。本文中“益元抑瘤汤”给药期间小鼠体重增加均匀，饮食、饮水量正常，小鼠比较活跃，毛色有光泽，精神状态良好，无明显副作用，可以通过调节自身的免疫功能，达到“带瘤生存”的目的。

白细胞介素2(IL-2)是由活化T细胞产生的多功能免疫应答调节剂，其最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期进入S期)和分化。IL-2能增强CD8+、CTL的杀伤活性，诱导其IL-2受体的表达，同时诱导各效应细胞分泌 IL-4、TNF、CSF等细胞因子［6］。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用特强的生物活性因子之一［7］。在本研究中，“益元抑瘤汤”能显著升高H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量，说明“益元抑瘤汤”通过增加H22荷瘤小鼠体内IL-2、TNF-α的分泌促进机体免疫。

T细胞通过细胞毒的直接杀肿瘤作用而抑瘤，或者分泌与肿瘤有关的细胞因子，如白细胞介素2(IL-2)、干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)等，形成细胞因子网，并通过网络内外的因子之间与细胞间的相互作用，共同杀伤肿瘤细胞［8］。B细胞为T细胞非依赖性细胞，在抗原刺激下可分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要执行机体的体液免疫。本实验表明:“益元抑瘤汤”组小鼠的T、B淋巴细胞转化能力均显著高于模型对照组，说明“益元抑瘤汤”对H22荷瘤小鼠脾脏T、B细胞增殖均具有促进作用。

巨噬细胞(M)是肿瘤免疫中的重要效应细胞，它在诱导特异性体液免疫和细胞性抗肿瘤免疫应答中占有重要地位，属于非特异性免疫［9］。它可以通过直接吞噬外来抗原或直接与瘤细胞结合而发挥杀瘤效应;也可以分泌某些产物抑制肿瘤的生长;还可以通过ADCC作用杀伤肿瘤［10］。“益元抑瘤汤”组的碳廓清指数κ和吞噬系数α均高于模型组，说明“益元抑瘤汤”能促进荷瘤机体免疫力的提高，可能通过以上某一途径产生抑瘤作用。

综上所述，“益元抑瘤汤”能增加H22荷瘤小鼠体内 IL-2、TNF-α 含量;对H22荷瘤小鼠脾脏 T、B 细胞增殖和巨噬细胞的吞噬功能有明显促进作用。“益元抑瘤汤”对荷瘤机体的免疫系统的影响达到了扶正祛邪的目的，显示了中医治疗肿瘤的特色，有利于肿瘤机体的恢复。

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