运动对RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠胸腺细胞凋亡及血液IL-2、IL-2R表达的影响①

汪君民 龚腾云 (南通大学体育科学学院，南通 226007)

视黄醇结合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪细胞分泌的，是一种特异性结合视黄醇的蛋白质［1］。研究发现，RBP4 这一脂肪因子会导致胰岛素抗性，在胰岛素抗性发展中起到一个关键作用，在具有胰岛素抗性的小鼠体内及肥胖、2 型糖尿病病人体内，血清RBP4 的水平升高［2］。升高的RBP4 水平与心血管危险因子关系密切，并且可用来作胰岛素抵抗程度的评价［3］。研究表明，运动训练可以降低不同年龄阶段的研究对象的RBP4 水平［3，4］，提示运动可以通过RBP4 水平的降低来提高胰岛素的敏感性。

糖尿病的病因及发病机制尚未完全阐明，但最近炎症学说颇受关注，认为炎症在其发病机制中起重要的媒介作用。其中多种细胞因子包括许多白细胞介素介导了此类反应。白细胞介素通过自分泌、内分泌和旁分泌的方式加速或者抑制此类炎症反应的过程。而其中的IL-2 与糖尿病的发病和进程，以及与糖尿病相关的心血管疾病的关系最为密切，并且IL-2 还具有炎症和免疫系统之外的重要调节作用，如通过全身给药IL-2 能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程［5］等。而在胰岛素抵抗情况下，运动导致IL-2 及其受体水平如何变化目前未见相关报道。

本文采用重组RBP4 注射活体大鼠，获得高RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠模型，观察运动后胰岛素抵抗和大鼠胸腺凋亡及免疫指标变化，为临床控制胰岛素抵抗及糖尿病预防提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 胰岛素(Sigma-Aldrich)、2-Deoxy-D-［I-3H］-glucose(Sigma-Aldrich)，RBP4 ELISA 试剂盒(Biosource)，胰岛素放射免疫试剂盒(Biogenesis)，重组RBP4(Alexis)，IL-2、IL-2R 定量试剂盒、考马斯亮蓝G250 蛋白测定试剂盒、凋亡细胞试剂盒均购自厦门慧嘉生物技术公司。酶联免疫检测仪、流式细胞仪(Beckman Coulter)等仪器。

1.2 方法

1.2.1 重组RBP4 注射与运动方案 雄性SD 大鼠8 周龄22 只，体重183～211 g，随机分成RBP4 +运动组(RE)10 只、RBP4 安静组(RR)6 只，2 组大鼠给予重组RBP4 腹腔注射［2］，3 μg/g 体重，每12 h一次，持续注射4 周。其余6 只为安静对照组(C)。RE 组大鼠按照Ploug 方法［6］进行游泳训练4 周，泳池为直径53 cm 内壁光滑的塑料桶，水深70 cm，水温为35±2℃，游泳训练开始时间为晚上6 点;大鼠先进行每天15 min 适应性游泳训练共2 天，从第3天开始采取每天无负重游泳，每次持续60 min，每周训练6 天，周日休息，共持续4 周。训练中，大鼠如出现反复下沉或溺水倾向，及时捞出，休息后片刻，再投入水中，直至补足60 min 训练时间;同时使用小木棍及时驱赶，使大鼠持续运动，避免其出现抱团、漂浮等现象，保证训练效果。将安静对照组大鼠在浸水后捞出。游泳结束后捞出，以干毛巾擦拭，暖风机吹干。

1.2.2 血清RBP4 和胰岛素抵抗指数的检测 采用双抗体夹心酶标免疫分析法测定RBP4;采用放射免疫分析法测定胰岛素。采用稳态模式评估法评价胰岛素敏感性，其原理是:假设外周组织和肝脏的胰岛素抵抗相等，按胰岛素和血葡萄糖在周围组织、肝和胰腺等相互影响而建立起来的数学模型。计算公式为［7］:HOMA-IR(胰岛素抵抗指数)=空腹胰岛素(国际单位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。胰岛素抵抗程度评估参照谢铁男［8］等人的计算方法。

1.2.3 胸腺细胞凋亡光镜观察 实验结束后断头处死动物，取出胸腺进行凋亡细胞原位末端标记及观察。采用TUNEL 方法［9］:将制备的胸腺组织石蜡切片脱蜡、乙醇水化，PBS 冲洗后蛋白酶K 消化，TDT 酶/生物素-dUTP 反应液等处理(具体步骤按试剂盒说明进行)，最后二甲苯透明，树胶封固，显微镜下观察结果并摄像。阳性标准为核呈棕红色、背景清晰。

1.2.4 IL-2、IL-2R 指标检测 外周血中IL-2、IL-2R 的含量检测用ELISA 法，参照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 大鼠血清中GM-CSF 水平检测 本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA 法。用抗鼠GM-CSF 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GM-CSF 与单抗结合，加入生物素化的抗人GM-CSF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm 处测OD 值，GMCSF 浓度与OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GM-CSF 浓度。

1.2.6 胸腺及脾脏指数 用分析天平称取胸腺及脾脏重量后，计算依据下列公式:胸腺(或脾脏)指数(g/100g)=100 ×胸腺(或脾脏)重量/体重。

1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS19.0 程序处理，以x-±s 表示，Kolmogorov-Smirnov 检验数据的正态分布，组间进行方差分析，采用LSD 检验，P ＜0.05 为差异具有统计学意义，P ＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 血清RBP4 和胰岛素抵抗指数变化 4 周后，RE 组和RR 组大鼠血清RBP4 水平显著高于C 组(P ＜0.01);RE 组大鼠血清RBP4 水平显著低于RR 组(P ＜0.01);RE 组和RR 组大鼠HOMA-IR 显著高于C 组(P ＜0.01);RE 组大鼠HOMA-IR 显著低于RR 组(P ＜0.01，见表1。

2.2 观察大鼠胸腺细胞凋亡的数量及分布部位 见图1。正常安静对照组(C):在胸腺皮质及髓质部位均可见被染成棕红色的凋亡细胞，阳性细胞占整个胸腺细胞比例较少。

RBP4 安静组(RR):在胸腺皮质及髓质部位见棕红色的凋亡细胞较正常对照组明显增多，阳性细胞占整个胸腺细胞的比例增大。RBP4 +运动组(RE):在胸腺皮质及髓质部位见棕红色的凋亡细胞较正常安静对照组增多，但较RBP4安静组明显减少。

2.3 外周血中IL-2、IL-2R 的表达变化 4 周后，RR 组和C 组大鼠外周血IL-2、IL-2R 表达差异不大;RE 组大鼠外周血IL-2 表达高于RR 组(P ＜0.05)，而IL-2R 表达明显低于RR 组(P ＜0.05);其比值高于RR 组(P ＜0.01)。见表2。

2.4 大鼠血清中GM-CSF 水平变化 4 周后，RR组和C 组大鼠外周血GM-CSF 水平相比明显增加，且具有显著差异性(P ＜0.01)，同时RE 组和C 组比较则没有显著性差异。见表3。

2.5 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化 4 周后，RR 组与C 组大鼠相比，体重、胸腺指数、脾脏指数都有所下降(P ＜0.05);而RE 组与C 组大鼠相比体重无显著差异，与RR 组比较胸腺指数(P ＜0.05)、脾脏指数明显提高(P ＜0.01)。见表4。

表1 血清RBP4 和胰岛素抵抗指数变化Tab.1 Changes in serum RBP4 and HOMA-IR of rats

表2 外周血中IL-2、IL-2R 的表达变化Tab.2 Changes of IL-2 and IL-2R expression

表3 大鼠血清中GM-CSF 水平Tab.3 Changes GM-CSF in serum of rats

表4 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化Tab.4 Changes of weight，thymus index and spleen index of rats

图1 各组胸腺皮质、髓质光镜下细胞凋亡情况Fig.1 Changes in thymus cortex and medulla of apoptosis

3 讨论

3.1 大鼠血清RBP4 变化情况 胰岛素抵抗不仅是2 型糖尿病的发病基础，还是代谢综合征(糖尿病、肥胖、高血压病、动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病)的共同病理基础。胰岛素能够提高组织对葡萄糖的摄取率，机制是胰岛素与靶细胞的胰岛素信号蛋白相互作用，最终能够增加葡萄糖转运体从细胞内池向细胞膜的运动［10］。胰岛素在不同的组织、细胞中通过复杂的信号级联放大作用发挥不同的生理作用。本研究中大鼠经过RBP4 注射4 周后，与C 组相比，RE 组和RR 组大鼠均出现胰岛素抵抗;对RBP4 注射后的大鼠进行运动干预后发现，虽然大鼠血清RBP4 水平仍高于C 组，但与RR 组比较胰岛素抵抗指数明显下降。与此对应的是:RE 组和RR 组大鼠胰岛素抵抗指数显著高于C 组，RE 组大鼠明显低于RR 组。说明运动能够抵抗RBP4 诱导的胰岛素抵抗。

3.2 光镜观察结果分析 细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡。是一种不同于坏死的、由基因调控的细胞主动死亡形式。细胞凋亡与免疫细胞的发育分化及行使功能等各个方面有密切的联系。有研究［11］指出:创伤应激大鼠胸腺细胞凋亡增多明显，同时其增殖能力降低，并且凋亡的细胞主要集中于胸腺依赖区的淋巴细胞，即T 细胞。探讨运动对胰岛素抵抗大鼠免疫细胞凋亡的影响，有助于胰岛素抵抗和糖尿病人群寻求更好的运动方式减轻胰岛素抵抗带来的免疫力的下降，提高患者的生活质量。

本研究结果显示:运动+RBP4 组在胸腺皮质及髓质部位见棕红色的凋亡细胞较正常安静对照组增多，但较RBP4 安静组明显减少。结果提示，RBP4 诱导的胰岛素抵抗不仅能影响外周成熟的T淋巴细胞功能，而且能影响中枢免疫器官中未成熟的淋巴细胞，胸腺细胞在发育成熟过程中凋亡增多，进而可能导致进入外周血循环中的成熟T 细胞减少，免疫力降低。本研究说明运动对RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠胸腺细胞凋亡有明显的抑制作用，可以增强胰岛素抵抗大鼠的免疫力。

3.3 大鼠外周血IL-2 及IL-2R 表达变化情况 IL-2 是由Th 细胞IL 抗原或丝裂原刺激下和IL-1 诱导下分泌的一种15 kD 的糖蛋白，能够促进淋巴细胞有丝分裂，增强杀伤细胞的杀伤功能和辅助抗体生成等，在机体的免疫应答及调节中起着重要的作用。血清IL-2 水平是末梢血单核细胞功能的一个敏感而又量化的指标，其生物学作用是通过和靶细胞上特异性高亲和力的IL-2R 相互作用来完成的。白细胞介素2 受体有两种，即存在于细胞表面的IL-2 膜受体(mIL-2R)和存在于体液中的可溶性IL-2 受体(IL-2R)，这两种受体都可结合IL-2，中和活化T 细胞周围过多的白介素2，具有免疫调控作用。IL-2具有增强荷瘤机体免疫功能的作用［12］。钱令波等［5］研究表明:IL-2 对大鼠的心脏收缩功能具有明显抑制作用;可明显改善糖尿病(高葡萄糖浓度)诱发的血管内皮依赖性舒张功能减弱;可减弱高葡萄糖浓度诱发的冠状动脉血管阻力的升高。

本研究结果表明，RE 组与RR 组大鼠血清IL-2表达升高、IL-2R 表达降低(P ＜0.05)，且IL-2/IL-2R 比值明显增大(P ＜0.01)，其升高机理可能是4周运动训练作用于激活的T 淋巴细胞，使其对IL-2R 表达与释放减少，而IL-2R 可结合血清中的IL-2，具有免疫抑制作用。结合钱令波［5］的研究结果，说明运动不但能够改善胰岛素抵抗大鼠的免疫机能，而且能够改善心脏舒张功能，减弱冠状动脉血管阻力的升高，为胰岛素抵抗患者提供了锻炼预防糖尿病的科学依据。

3.4 大鼠血清中GM-CSF 水平变化 GM-CSF 是一种来源于T、B 淋巴细胞、巨噬细胞、纤维细胞及间质细胞的一种糖蛋白，在炎症反应过程中由损伤内皮细胞释放的一种多肽类激素样造血生长因子，它可促进造血祖细胞分化成单核巨噬细胞，并维持单核巨噬细胞的生长、增殖、分化，为炎症反应的敏感的标志物［13］。它可刺激骨髓早期母细胞分化，并促进这些细胞的成熟和增殖，对机体的免疫、抗感染、造血能力具有重要的调节和促进作用。是联系生物体内三大调节系统的重要介质。它可通过影响网络调节系统，引起免疫调节功能的紊乱，特别是表现在T、B 细胞比例发生紊乱，使CD4/CD8 比值发生改变［14］。

本文结果表明，RR 组血清中GM-CSF 水平非常显著地高于正常安静对照组(P ＜0.01)，而RE 则与正常安静对照组比较无显著差异(P ＞0.05)，这一结果表明，血清GM-CSF 确实与胰岛素抵抗发生和发展密切相关。其升高的机理有可能是:由于RBP4 引起的大鼠胰岛素抵抗导致细胞免疫功能受到抑制，大鼠机体存在非特异性免疫调控增强之故。但具体是由于过度活化的T 细胞分泌增加所致，还是其他因子分泌增加所致，抑或是骨髓干细胞及基质细胞异常分泌增加所致尚需深入研究。RE 组血清中GM-CSF 水平变化不具显著性，可能是运动训练部分恢复了细胞免疫功能，从而抵消了RBP4 引起的胰岛素抵抗，其具体机理需要进一步探索。

3.5 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数组间关系 胸腺为中枢免疫器官，是T 淋巴细胞发育及成熟的场所。脾是人体最大的外周免疫器官，B 淋巴细胞在此发育、成熟，脾也是机体在抗原刺激下发生免疫应答的场所。因此胸腺、脾脏结构的衰退和功能下降势必会影响机体的体液、细胞免疫功能，导致机体免疫功能失调。胸腺指数和脾指数是依据机体体重来计算的，是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指标［15］，二者的高低变化反映了机体体内免疫功能的状态。

本实验结果显示RR 组大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数均低于正常安静对照组C 组，表明RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠体重胸腺指数、脾脏指数明显降低。而RE 组胸腺指数、脾脏指数均高于RR 组，则说明耐力运动能显著提高模型大鼠胸腺指数及脾脏指数，提高机体体液、细胞免疫功能，增强防病抗病能力。

总之，RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠免疫功能有所下降，具体表现为:与对照组(C)相比，RBP4 诱导组的HOMA-IR、胸腺的凋亡细胞、血清IL-2、IL-2R 的表达及血清GM-CSF 分别发生改变;运动干预后，RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠下降的免疫功能部分恢复，具体表现为:与对照组(RR)相比，RBP4诱导组的HOMA-IR、胸腺的凋亡细胞、血清IL-2、IL-2R 的表达及血清GM-CSF 分别发生改变。

3.6 研究缺陷和进一步研究的方向 本试验只采用了游泳这种单一的练习方式，没有设置专门的力量练习组。而有文献认为，适当的力量或抗阻力方案设计对不适合进行走、慢跑、有氧健身操等练习的2 型糖尿病患者是可行而且有效的［16］。

缺乏胸腺细胞凋亡的定量研究，RBP4 与血清GM-CSF、IL-2 等之间的关系没有进一步探讨，也是以后研究的方向。

运动能够明显提升RBP4 诱导的胰岛素抵抗大鼠胸腺细胞抗凋亡能力和免疫能力。该研究在探讨胰岛素抵抗患者免疫功能紊乱的发生机制和临床治疗方面有所启示。

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