摇晃蛋白引起神经元分枝并促进树突发育①

卢 习 范 力 邵 虹 段明慧 陈树林 赵善廷 (西北农林科技大学动物医学院，杨陵 712100)

哺乳动物的大脑皮质是一个高度有序的复杂结构，从软脑膜(Pial mater)到白质(White matter)是由不同类型的细胞排列而成的六层结构，每一层的神经元具有相似的形态结构和功能特性，并且在同一时间起源于同一地点［1］。在哺乳动物大脑皮质发育时期，有丝分裂后的神经元从它们的发源地沿着放射状胶质细胞的突起向软脑膜迁移，最后会以“由内而外”(Inside out)的方式形成高度有序排列的六层结构［2］，即较早出生的神经元最终定位于皮层深处，而晚出生神经元最终占据着浅层区域。神经元迁移缺陷会导致许多神经元疾病，例如无脑回(Lissencephaly)、癫痫(Epilepsy)、智力迟钝(Mental retardation)和严重的学习障碍(Iearning disabilities)［3，4］。神经元迁移依靠不同信号通路的精确调控，其中最具特色的是摇晃蛋白(Reelin)信号通路。

在大脑皮质发育过程中，位于边缘带(Marginal zone，MZ)的Cajal-Retzius 细胞(CR cells)分泌的一种细胞外基质蛋白，称为摇晃蛋白(Reelin)。在大脑皮质发育过程中，摇晃蛋白控制着神经元迁移和大脑皮质的形成过程。在缺失摇晃蛋白的突变体小鼠(摇晃小鼠，Reeler mouse)的大脑皮质、海马和小脑中神经元的迁移严重受阻，最终导致层结构的反转［5］。

以前研究发现，除了大脑皮质的层结构反转外，纯合子摇晃小鼠海马中树突发育异常，排列紊乱［6，7］。树突分枝朝向紊乱的程度与细胞层异位的程度相一致，表明发育树突的朝向受位置信号的影响。杂合子摇晃小鼠在没有出现细胞层异位的情况下仍表现出树突长度变短，树突棘(Dendritic spine)密度减小［8］，这表明摇晃蛋白的缺失本身可能影响树突发育和神经元成熟。

本研究通过子宫内电击转染的方法，标记迁移中的神经元，观察到在接近含摇晃蛋白的MZ 附近，迁移神经元开始出现分枝，表现出与在迁移中完全不一样的表型。通过分析发现摇晃蛋白引起神经元分枝，因此神经元的发育与摇晃蛋白之间有着密切的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究工作中使用的动物为孕期E15.5 的野生型C57BL/6J 小鼠。成年C57BL/6J小鼠(2 月龄)购自于西安交通大学实验动物中心。小鼠首先放置于实验室鼠房［室温(22±1)℃，相对湿度50%～60%］适应7 d。按照雌∶雄=2∶1 的比例进行合笼，次日上午检查阴栓，若见阴栓，当天中午记为E0.5(Embryonic day 0.5)。小鼠出生的当天记为P0(Postnatal day 0)。

1.2 子宫内电击转染 子宫内电击转染实验方法参照Saito 等［9］的文献进行，并做适当修改。

取E15.5 孕鼠，用0.7%戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射(70 mg/kg)，麻醉后将其腹部向上置平板上，用碘伏和酒精棉反复交替消毒腹部皮肤，用中间开口的无菌手术垫单覆盖腹部，沿腹中线剪开皮肤和肌肉，将一侧子宫轻轻拉出，找到脑部人字缝，判断侧脑室的位置，以左手固定胎鼠，用玻璃微注射针(图1A、C 中箭形所示)将pCAG-GFP(Plasmid 11150，Addgene，Cambridge，MA，USA)1.5 μl/μg 注射到鼠胚一侧侧脑室，其中含0.01% 固绿(Fast green)作为指示剂，用板状电极(图1B、D 黑色所示)轻轻夹住胎脑，按照如下参数进行电脉冲刺激:电压45 V，脉冲时间50 ms，脉冲间隔950 ms，电击次数5 次。在此过程中，持续往子宫上滴加预热到37℃的无菌生理盐水。转染完毕，将子宫轻轻放回腹腔中，以预热生理盐水灌满腹腔后将肌肉和皮肤分别缝合。手术完毕，将母鼠放回笼中，保温至清醒，分别饲养至转染后3 d 或5 d 后，打开母鼠腹腔，取出胚胎，若出生则取新生小鼠灌注取材。

1.3 荧光免疫组织化学染色 取出的胚胎大脑在4%多聚甲醛中固定3 d 后，用4%琼脂包埋，振荡切片机切片，厚度50 μm，于pH7.4 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液(Phosphate buffer，PB)中保存，随后进行免疫荧光染色。

荧光免疫组织化学染色采用“三步法”在24 孔培养板中进行漂片染色，孵育及漂洗过程均在低速摇床上进行。使用的一抗包括:rabbit anti-GFP(1∶1 000;A-11122，Invitrogen，Karlsruhe，Germany)，mouse anti-Reelin G10 (1 ∶1 000;MAB5364，Millipore，Billerica，MA，USA);二抗包括goat anti rabbit-Alexa Fluor 488，goat anti mouse-Alexa Fluor 568。用PI(Propidium iodide，2.5 mg/ml;P3566，Invitrogen，Karlsruhe，Germany)或DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole，1 ∶10 000;236276，Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)室温下复染15 min 以标记细胞核。脑片用防荧光淬灭剂(Fluorescence Mounting Medium，S3023，DAKO，Copenhagen，Denmark)封片，然后在Zeiss LSM 510激光共聚焦显微镜下观察结果并拍照。

1.4 荧光显微观察与激光共聚焦显微拍照 在Nikon 荧光体视显微镜下观察取出的完整的小鼠脑或胚胎脑，确定转染效果及GFP 表达的脑区。在Zeiss LSM 510 激光共聚焦显微镜下主要观察被GFP 标记上的细胞的形态以及分布的部位。

图1 子宫内电击转染示意图Fig.1 Illustration of in utero electroporation procedure

1.5 细胞形态分析 使用Zeiss LSM510 激光共聚焦显微镜(×60，1.4 倍物镜孔径)对切片进行z 轴连续扫描拍照，然后通过Zeiss ZEN 2010 软件依据“最大像素密度”将每一组照片进行叠加成一个平面。通过Neuromantic 软件描绘出单个神经元的形态和突起。细胞的每根突起的长度可以通过Image J 软件测量出来。为了分析突起的形态特征，本实验分析了以下两个参数:总的分枝长度(Total branch length，TBL)及分枝点(Bifurcation)数目。将从顶突起上伸出的长度大于2.5 μm 的GFP 阳性突起定义为初级分枝，从顶突起上伸出的长度小于2.5 μm 的不稳定丝状伪足不计入分枝内。将从神经元胞体和顶突起间的收缩部位到第一个分枝点的距离定义为剩余顶突起的长度(Length of leading process)。

1.6 统计学分析 所有数据用统计软件SPSS17.0进行统计学分析，组间的比较进行单因素方差分析(ANOVA)和Dennet t 检验。所有结果以±s 表示，P ＜0.05 记为数据有显著性差异。

2 结果

2.1 摇晃蛋白局限性分布于发育中大脑皮质的MZ 用G10 抗体做免疫组织化学染色可以显示摇晃蛋白在胚胎大脑皮质中的分布位置。G10 抗体是一种单克隆IgG 抗体，可以识别摇晃蛋白N 末端序列上的第164～496 位氨基酸。免疫组化结果显示，摇晃蛋白主要分布在大脑皮质胞核较为稀疏的MZ区，呈现出一种较好的弥散性的分布模式(图2 A，A')。在放大图中可以看到，MZ 中许多细胞显示出强烈的摇晃蛋白阳性，呈现出典型的CR 细胞特征，水平朝向，带有粗的突起的双极形态，胞体为卵圆形或梭形(箭头)。在MZ 中的CR 细胞之间，检测到较强的、呈弥散点状分布的摇晃蛋白分布(图2 B，B')。

图2 胚胎期大脑皮质中摇晃蛋白的分布Fig.2 Restricted expression of Reelin in embryonic cerebral cortex

图3 通过子宫内电击转染技术用GFP 标记胚胎大脑中神经元Fig.3 Neurons were labeled by GFP in embryonic brain transfected using in utero electroporation

2.2 利用子宫内电击转染技术成功标记迁移神经元 利用子宫内电击转染技术，在小鼠胚胎的不同发育时期，将带有CAG 启动子的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表达质粒(pCAGGFP)注射入小鼠胚胎侧脑室，在一定的电脉冲刺激下，外源质粒进入胚胎侧脑室的室带中的神经前体细胞中，在CAG 启动子的驱动下，GFP 在转染中的细胞中表达。

图4 摇晃蛋白促进神经元的分枝和树突的发育Fig.4 Reelin promoted branching of neurons and dendritic development

在不同的发育阶段，将剥离头盖骨的小鼠胚胎完整脑组织或是出生后小鼠脑组织放置于Nikon 荧光体视显微镜下，在质粒浓度较高及恰当的转染条件下可以直接观察到强烈的GFP 阳性表达(图3C)。

在E15.5 d 进行子宫内电击转染，3 d 后E18.5 d 固定的小鼠胚胎大脑中，可以观察到在发育中的大脑皮质的皮质板(Cortical plate，CP)、中间带(Intermediate zone，IZ)和室带(Ventricular zone，VZ)/亚室带(Subventricular zone，SVZ)中均有大量的GFP 阳性的细胞被成功标记(图3A，A')。在CP 中的GFP 阳性的细胞表现出迁移神经元典型的双极形态特征，具有卵圆形的胞体、一条长、粗的顶突起伸向软脑膜和一条短、细的尾突起伸向侧脑室(图3 A 插图)。一些GFP 阳性的细胞已经到达CP 的浅层区域，并且它们的顶突起非常接近或已经侵入MZ 中(图3A，A')。转染5 d 后(P1)检测结果，发现大部分GFP 阳性细胞聚集于MZ 的边缘，并形成一条致密的带。它们向MZ 中伸出一些小的分枝(图3B，B')。GFP 标记出的细胞的形态暗示出它们是神经元。

为了证实这些被GFP 标记的细胞确实是神经元我们进行了双皮质素(Doublecortin，DCX)免疫组化染色。DCX 是一种微管相关蛋白，被普遍认为是有丝分裂后迁移神经元的标记物［10，11］，即能显示出该神经元未成熟的特征。实验结果表明，在电击转染后第3 天检测结果，发现在大脑皮质的CP 中大部分GFP 阳性细胞都是DCX 阳性的(图3D)，表明在E15.5 用GFP 质粒转染，且在3 d 或是更长时间后在大脑皮质中标记出的细胞的确是神经元。

2.3 摇晃蛋白引起神经元产生分枝促进树突发育 已有研究表明，当迁移神经元的顶突起接触到CP-MZ 的边界线时，迁移神经元便将其迁移方式由依赖胶质细胞的整体运动式迁移转变成胞体位移式迁移的方式，以完成最终的迁移过程。为了研究摇晃蛋白在这一过程中的作用，将迁移神经元按照其所处位置分成两类:(1)在皮质板中迁移的神经元，神经元的胞体和顶突起都位于大脑皮质板中(图4A);(2)已接触到摇晃蛋白的迁移神经元，神经元的胞体接近或接触到CP-MZ 交界线且其顶突起已经接触到摇晃蛋白丰富的MZ 区(图4B)。为了方便统计，利用Neuromantic 软件对每组中典型的神经元进行示踪，并画出其模式图(图4C)。

研究发现，顶突起接触到摇晃蛋白丰富的MZ区域的神经元和顶突起仍在大脑皮质板中的神经元在突起的分枝程度上有明显的差异。在大脑皮质板中仍然进行整体运动式迁移的神经元的顶突起朝向MZ 区，并没有出现分枝(图4A)，而当迁移神经元的顶突起刚接触到摇晃蛋白丰富的MZ 区域时，顶突起的末端开始出现分枝，并且随着迁移神经元继续向上迁移，胞体离摇晃蛋白丰富的MZ 区域越近，顶突起的长度越来越短，此时，顶突起上的分枝数目越来越多(图4 B、D)。迁移神经元的胞体最终会停留在大脑皮质板的最上端而不侵入摇晃蛋白丰富的MZ 区域中，此时，神经元的顶突起完全消失，出现了大量的、繁茂的树枝状的突起。

为了对比位于大脑皮质板中的神经元和顶突起接触到MZ 区域的神经元的形态特征，测量神经元顶突起的长度和其对应的突起的长度并且计数每一个神经元的顶树突上的分枝点数。大脑皮质板中迁移神经元的顶突起的长度为(65.73±10.88)μm。随着神经元向上迁移，剩余顶突起的长度越来越短，神经元顶树突上的分枝的长度越来越长且分枝点越来越多。定量分析结果显示，神经元的剩余顶突起的长度与总的分枝长度呈极显著负相关(n=42，r=-0.700，P=2.44E-7;图4D)，且与分枝点的数目呈极显著负相关(n=39，r=-0.701，P=2.28E-7;图4E)。

3 讨论

3.1 摇晃蛋白促进神经元分枝在神经元迁移中的作用 利用胚胎大脑皮质脑片培养方法来研究神经元迁移模型［12］，在顶突起(平均长度为30～50μm)接触到MZ 后，胞体运动的方式由跳跃性转向连续性，并且胞体迁移的平均速度由35 μm/h 增加到60 μm/h。迁移神经元的顶突起一旦接触到摇晃蛋白丰富的MZ，顶突起便开始产生初生的分枝，神经元的迁移方式也会转变成胞体位移式迁移的形式，这种迁移方式是不依赖于放射状胶质细胞的［12］。在这个过程中，顶突起越来越短，在摇晃蛋白丰富的MZ 中的分枝越来越多，迁移神经元的胞体也得以快速向上继续迁移，这种迁移的动力可能来自于摇晃蛋白引起的神经元顶突起的快速的形态学改变而产生的向上的牵引拉力。一方面，这些分枝可以锚定在MZ 中，提供这种类似“引体向上”式的牵引力，为神经元最后通过胞体位移式迁移到达最终位置提供动力;另一方面，当迁移神经元的胞体到达被细胞外基质中摇晃蛋白包围着的初级分枝点时，分枝点阻止了神经元细胞核在顶突起中向上移动，因此神经元停止迁移。摇晃蛋白引起的顶突起的分枝便起到了终止信号的作用。

3.2 摇晃蛋白对神经元的树突发育的影响 在本研究中，使用子宫内电击转染方法成功将GFP 标记并追踪正在迁移的神经元，这就使得在体观察到神经元在不同的发育阶段时的形态特征成为可能。结合摇晃蛋白免疫组化染色，神经元在摇晃蛋白阳性的MZ 区出现分枝，可以推论摇晃蛋白促进神经元产生分枝。

之前的研究表明，纯合子摇晃小鼠中除了皮层反转外，另外一个显著的特征是顶突起和树突发育受损，朝向紊乱，放射状胶质细胞的突起发育异常［7］。杂合子摇晃小鼠中没有出现细胞层紊乱，但是树突发育仍受到影响［9］，说明摇晃蛋白本身可能影响树突的发育。将重组的摇晃蛋白加到培养基中后可以促进纯合子摇晃小鼠海马神经元的树突的生长［7］。以前有报道表明摇晃蛋白在大脑皮质和海马神经元的树突棘周围的细胞外基质中聚集［13］，在杂合子摇晃小鼠中细胞层并没有出现异位的情况下小棘的密度仍然减少了，说明摇晃蛋白可以调节生后小鼠树突的发育［14］。另外，摇晃蛋白可以促进海马神经元树突棘的发育，使其变得过度肥大［15］。综上所述，表明摇晃蛋白可以直接调节神经元的分枝和树突的发育。

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