一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的分离及其氧化活性的研究

邓呈逊等

摘 要：本研究从铜陵新桥矿区的高硫矿堆废水中分离一株嗜酸菌S t1，经生理生化特征及16S rDNA分子鉴定，确定其为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌。该菌株分别在含有FeSO4·7H2O、S0、黄铁矿石颗粒（FeS2）的9K无机盐液体培养基中获得生长所需要的能量。结果嗜酸菌S t1对Fe2+氧化速率最快，培养到36h时溶液中44.1g·L-1 FeSO4·7H2O有95%被氧化；S0为能量底物的培养体系中，培养到26d时培养液中SO42-浓度达到2.241 2 mg·mL-1，pH值降至1.18；黄铁矿石颗粒（FeS2）为能量底物的培养体系中，SO42-平均生成速率为1.360 2 mmol·L-1·d-1，黄铁矿石颗粒氧化速率达到0.068mmol·d-1·g-1。

关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；分离；氧化活性

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）11-27-04

Abstract：A strain of Acidithiobacillus ferrooxidans was isolated from the acid mine drainage of Xinqiao Coal Mine， Tongling county. Strain S t1 was identified as Acidithiobacillus ferrooxidans by morphological and phylogenetic analysis of its 16S rDNA gene sequence. Its oxidation activity with ferrous ion（Fe2+）、elemental sulfur（S0） and pyrite （FeS2）as substrates in 9K medium was studied. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with 44.1g·L-1 FeSO4·7H2O as the substrates， 95%of the FeSO4·7H2O was oxidized in 36h. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with S0 as the substrates， 2.241 2 mg·mL-1 SO42- concentration， pH value 1.18 was observed in 26d. When the A.f strain was cultured in 9K mediun with FeS2 as the substrates， the average rate of SO42- product was 1.360 2mmol·L-1·d-1，The rate of oxidation of FeS2 was 0.068 mmol·d-1·g-1.

Key words：Acidithiobacillus ferrooxidans；Isolation；Oxidation activity

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f）等矿山酸性废水微生物通过对硫化物矿物的生物氧化作用，加速了酸性矿排水（Acid Mine Drainage，AMD）的形成及重金属元素等有害物质的释放，对矿山周边土壤和水体等生态环境造成严重的酸性水与重金属污染[1-3]。因此，研究矿山环境微生物对其所处环境介质的氧化作用，对矿山AMD环境防治等有着重要的意义[4]。自Colmer等[5]1947年首次从矿山酸性废水中分离得到1株A.f以来，对这一类群微生物的筛选及应用成为环境领域的研究热点。由于该类微生物存在生物多样性，对生物脱硫、生物浸矿、重金属脱除等不同的应用领域需使用相应生物学特征的菌株，因此分离、收集特定地域环境中的高效微生物，对加强相关应用领域的研究显得非常重要。在A.f菌的应用过程中，硫、亚铁离子的生物氧化被认为是非常关键的环节[6]。鉴于此，本研究从铜陵新桥矿区的高硫矿堆废水中分离、纯化得到一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，命名为嗜酸菌S tl，研究了该菌株的形态特征及16S rDNA序列分析，确定其系统分类地位，并考察该菌株在不同底物能源物质中的氧化活性，以期为利用该菌株进行煤炭生物脱硫应用研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 用于嗜酸微生物培养、分离与纯化的的酸性水样品采自铜陵新桥矿区的高硫矿堆废水，pH为2.5。黄铁矿（FeS2）：采自铜陵硫铁矿固废堆，电感耦合等离子体–质谱法（ICP-MS）检测其主要成分为黄铁矿。将采集的黄铁矿样品粉碎过筛，取80～120目黄铁矿颗粒置于干燥器中备用。

1.2 嗜酸菌的的分离纯化 取适量酸性废水10mL接种到100mL 9K液体培养基中，在温度28℃，转速180r/min的摇床中进行摇瓶培养，按照同样的方法将培养的菌液再转接富集2次得富集菌液。取富集培养的菌液1mL加入90mL灭菌9K液体培养基中进行摇瓶培养，当培养基颜色由澄清变为红棕色，瓶底出现较多黄色沉淀时，取1mL富集菌液进行梯度稀释，每个梯度的稀释液均匀涂布在固体培养基上，28℃恒温培养箱倒置培养10d左右。挑取单菌落进行多次划线分离、液体富集培养，分离出纯A.f菌株。挑取单菌斑进行革兰氏染色法和镜检观察。

1.3 嗜酸菌株的16S rDNA鉴定

1.3.1 菌体总DNA的提取 取200mL菌液，1 000r低速离心10min去杂质→10 000r高速离心20min收集菌体→1∶1稀硫酸（pH =2）洗涤3次，离心收集菌体→上海生工Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取。

1.3.2 16S rDNA扩增及序列分析 50μLPCR反应体系：模版DNA（50ng/μL）2uL、10μM引物1（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）4μL、10μM引物2（1492R：5-TACGGYYTACC TTGTTACGACTT-3）4μL、10×PCR 缓冲液5μL、2.5mM Mg2+ 3μL、10mM dNTP 2μL、5u/μLTaq DNA聚合酶2uL、无菌H2O 28μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min→95℃解链30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循环35次，延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶检测扩增产物，凝胶成像系统观察电泳结果。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果提交GenBank进行blast比对，鉴定菌株种属。

1.4 A.f菌对Fe2+、单质硫、黄铁矿颗粒（FeS2）的氧化活性 取无机盐培养液80mL于250mL三角瓶中，接入菌液20mL，分别以44.1g·L-1FeSO4·7H2O、10g·L-1单质硫粉、1g80～120目的黄铁矿（FeS2）颗粒为底物，调节起始pH值到2.5，28℃、转速180r/min振荡培养，定期取培养上清液测pH值：玻璃电极法（GB 6920-1986）[7]；Fe2+浓度：邻菲罗啉分光光度法[8]；SO42-浓度：硫酸钡比浊法[9]。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态特征及16SrDNA鉴定 分离得到的菌株在固体培养基上培养10d左右，平板上出现边缘整齐、表面干燥的圆形单菌落。在培养初期菌落呈白色，后期呈黄褐色。菌落直径在1.5mm左右，中部突起、质地较硬。显微镜下呈杆状或链杆状，为革兰氏阴性菌。图1显示：筛选到的菌株与与嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f）亲缘关系较近，16S rDNA序列相似性达到98%以上。综上，经形态学及16S rDNA分子鉴定，可判断其为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，命名为S tl。

2.2 嗜酸菌S tl对Fe2+的氧化活性 在9K液体培养基中，嗜酸菌S tl以FeSO4·7H2O为能源底物，氧化Fe2+成Fe3+。嗜酸菌S tl在9K液体培养基中的一个氧化反应周期内，培养液颜色最初为浅乳黄色，2d左右颜色变深，呈橘色，3～4d左右出现黄色沉淀物，颜色继续变深，7d左右大量黄色沉淀物附着在瓶底和瓶壁，培养液颜色变为铁锈色。

由图2可知，嗜酸菌S tl以FeSO4·7H2O为能源的培养体系中，前12hFe2+氧化率小于10%，12h后Fe2+氧化速率迅速增加，36h后Fe2+氧化速率达95%。岳兴玲等人研究一株源于煤矸石的氧化亚铁硫杆菌对Fe2+的氧化速率可达93%，其氧化活性略低于本研究中的嗜酸菌S tl。图3中，培养液pH值不断持续下降，0～12h内培养液pH值从2.5降到1.9，之后随着培养时间的延长逐渐缓慢下降，48h后pH值降至1.7左右。嗜酸菌S tl通过自身代谢将Fe2+转化为Fe3+，Fe3+浓度逐渐增高，Fe3+水解、与溶液中离子结合产生络合物过程中会产生大量H+，故培养体系中pH值不断下降，这一结果与刘玉娇等人的研究结果相一致。

2.3 嗜酸菌S tl对单质硫的氧化活性 在有氧条件下，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌以元素硫为能源，S0被氧化为SO42-，使培养液中SO42-浓度增加，pH降低，以此获得生命活动的所需能量。其离子方程式为：S+H2O+1.5O2→2H++SO42-。故可用氧化体系中SO42-浓度、pH值的变化趋势来反映嗜酸性氧化亚铁硫杆菌对S0的氧化活性。

由图4可知，在培养的前3dSO42-生成速率很低，6d后SO42-浓度开始不断大幅增高，19d时达2.162 2mg·mL-1，反应至26d结束实验，培养液中SO42-浓度达到2.241 2mg·mL-1。由表5可知，培养液pH值一直呈下降趋势，前3dpH值下降较缓慢，从第3天开始才有较大幅度下降，19d后pH值下降开始变缓，26d反应结束时pH值降至1.18。培养液颜色出现从澄清透明、淡黄色、颜色加深至培养液浑浊的变化。3d以前培养液基本澄清透明，S0颗粒粘连在器壁上或漂浮在培养基液体表面。培养至第6天始，漂浮在培养基液体表面的S0粉颗粒逐渐减少、溶解，培养液呈均一的淡黄色，随着培养时间的延后，培养液颜色逐渐加深。

综上，嗜酸菌S tl对S0的氧化效率远远低于对Fe2+的氧化效率。以上现象表明嗜酸菌S tl在接种初期有一段延滞期，菌体数及氧化活性不高，需要调节自身生理机制来适应生长环境，可见嗜酸菌S tl对固体S0粉颗粒的利用比对Fe2+的利用情况更复杂。单质硫本身的理化特征也影响了嗜酸菌S tl对S0的氧化效率。单质硫粉疏水强，不易溶于水。有研究表明当嗜酸性氧化亚铁硫杆菌以单质硫为底物生长时，涉及到菌对S0粉固体颗粒表面吸附，菌体表达的表面活性物质透过细菌壁扩散，促进细菌与硫的接触等一系列复杂的传质过程[12]。由于嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的疏水性，在单质硫颗粒表面吸附慢，使得菌体对S0粉的吸附传质步骤成为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌对单质S氧化过程中的限速步骤[13]。随着细菌对新环境的适应、氧化硫相关酶系统的启动，延滞期过去，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌开始以S0为能量底物进行生长繁殖。

3 结论

（1）从铜陵新桥矿区的高硫矿堆废水中分离、纯化得到一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，菌落呈圆形，直径1.5mm左右，黄褐色、质地较硬、中部突起。显微镜下呈杆状或链杆状，革兰氏阴性菌。

（2）分离纯化得到的嗜酸菌S tl可以利用Fe2+、S0、FeS2获得能量生长，对Fe2+的氧化速率最快。

（3）28℃，180/min，初始pH值为2.5的培养条件下，嗜酸菌S tl以Fe2+为能量底物时，培养到36h时95%FeSO4·7H2O被氧化；S0为能量底物时，培养到26d时培养液中SO42-浓度达到2.241 2mg·mL-1，pH值降至1.18；黄铁矿石（FeS2）为能量底物时，SO42-平均生成速率为1.360 2mmol·L-1·d-1，黄铁矿氧化速率达到0.068mmol·d-1·g-1。

参考文献

[1]BRIERLEY C L. Microbiological mining[J]. Scientific American.， 1982， 247（2）：42–50.

[2]阎葆瑞，张锡根.微生物成矿学[M].北京：科学出版社，2000.

[3]Baker B J， Banfield J F. Microbial communities in acid mine drainage[J].FEMS Microbiol Ecol， 2003，44：139-152.

[4]邓呈逊，岳梅，王玲玲，等.氧化亚铁硫杆菌对黄铁矿的表生风化试验研究[J].安全与环境学报，2013（3）：83-89.

[5]Colmer A R， Hinker M E. The role of microorganisms in acid mine diainage：A preliminary report[J]. Science， 1947， 106（2 751）：253-256.

[6]Wang J W， Bai J F， Xu J Q， et al. Bioleaching of matala from printed wire boards by Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans and their mixture[J]. Journal of Hazardous Materials， 2009， 172（2-3）：1 100-1 105.

[7]国家环境保护局.中华人民共和国国家标准GB6920-86水质PH值的测定玻璃电极法[S].北京：中国标准出版社，1987.

[8]国家环保总局《水和废水监测分析方法》编委会. 水和废水检测分析方法[M]. 北京：中国环境科学出版社， 2002：279-281.

[9]储亮侪，周金生， 董高翔，等. 地下水标准检验方法[J].地质实验室，1988， 4（增刊）：98-99.

[10]岳兴玲，王海霞.一株源于煤矸石的T.f菌分离及生理特性[J].济南大学学报（自然科学版），2013，27（3）：254-257.

[11]刘玉娇，杨新萍，王世梅，等. 1株分离自煤矿废水的铁硫氧化细菌LY01的极其氧化特性的研究[J].环境科学，2013，34（5）：1 930-1 936.

[12]Kovaleva T V，Karavaiko G I， Piskunov V P. Identification and distribution of sulfur in Thiobacillus ferrooxidans cells[J]. Mikrobiologiya，1983，52（3）：455-460.

[13]宫磊. 生物催化氧化法处理H2S废气的工艺及理论研究[D]. 昆明：昆明理工大学，2005：87-101.

（责编：张宏民）

参考文献

[1]BRIERLEY C L. Microbiological mining[J]. Scientific American.， 1982， 247（2）：42–50.

[2]阎葆瑞，张锡根.微生物成矿学[M].北京：科学出版社，2000.

[3]Baker B J， Banfield J F. Microbial communities in acid mine drainage[J].FEMS Microbiol Ecol， 2003，44：139-152.

[4]邓呈逊，岳梅，王玲玲，等.氧化亚铁硫杆菌对黄铁矿的表生风化试验研究[J].安全与环境学报，2013（3）：83-89.

[5]Colmer A R， Hinker M E. The role of microorganisms in acid mine diainage：A preliminary report[J]. Science， 1947， 106（2 751）：253-256.

[6]Wang J W， Bai J F， Xu J Q， et al. Bioleaching of matala from printed wire boards by Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans and their mixture[J]. Journal of Hazardous Materials， 2009， 172（2-3）：1 100-1 105.

[7]国家环境保护局.中华人民共和国国家标准GB6920-86水质PH值的测定玻璃电极法[S].北京：中国标准出版社，1987.

[8]国家环保总局《水和废水监测分析方法》编委会. 水和废水检测分析方法[M]. 北京：中国环境科学出版社， 2002：279-281.

[9]储亮侪，周金生， 董高翔，等. 地下水标准检验方法[J].地质实验室，1988， 4（增刊）：98-99.

[10]岳兴玲，王海霞.一株源于煤矸石的T.f菌分离及生理特性[J].济南大学学报（自然科学版），2013，27（3）：254-257.

[11]刘玉娇，杨新萍，王世梅，等. 1株分离自煤矿废水的铁硫氧化细菌LY01的极其氧化特性的研究[J].环境科学，2013，34（5）：1 930-1 936.

[12]Kovaleva T V，Karavaiko G I， Piskunov V P. Identification and distribution of sulfur in Thiobacillus ferrooxidans cells[J]. Mikrobiologiya，1983，52（3）：455-460.

[13]宫磊. 生物催化氧化法处理H2S废气的工艺及理论研究[D]. 昆明：昆明理工大学，2005：87-101.

（责编：张宏民）

参考文献

[1]BRIERLEY C L. Microbiological mining[J]. Scientific American.， 1982， 247（2）：42–50.

[2]阎葆瑞，张锡根.微生物成矿学[M].北京：科学出版社，2000.

[3]Baker B J， Banfield J F. Microbial communities in acid mine drainage[J].FEMS Microbiol Ecol， 2003，44：139-152.

[4]邓呈逊，岳梅，王玲玲，等.氧化亚铁硫杆菌对黄铁矿的表生风化试验研究[J].安全与环境学报，2013（3）：83-89.

[5]Colmer A R， Hinker M E. The role of microorganisms in acid mine diainage：A preliminary report[J]. Science， 1947， 106（2 751）：253-256.

[6]Wang J W， Bai J F， Xu J Q， et al. Bioleaching of matala from printed wire boards by Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans and their mixture[J]. Journal of Hazardous Materials， 2009， 172（2-3）：1 100-1 105.

[7]国家环境保护局.中华人民共和国国家标准GB6920-86水质PH值的测定玻璃电极法[S].北京：中国标准出版社，1987.

[8]国家环保总局《水和废水监测分析方法》编委会. 水和废水检测分析方法[M]. 北京：中国环境科学出版社， 2002：279-281.

[9]储亮侪，周金生， 董高翔，等. 地下水标准检验方法[J].地质实验室，1988， 4（增刊）：98-99.

[10]岳兴玲，王海霞.一株源于煤矸石的T.f菌分离及生理特性[J].济南大学学报（自然科学版），2013，27（3）：254-257.

[11]刘玉娇，杨新萍，王世梅，等. 1株分离自煤矿废水的铁硫氧化细菌LY01的极其氧化特性的研究[J].环境科学，2013，34（5）：1 930-1 936.

[12]Kovaleva T V，Karavaiko G I， Piskunov V P. Identification and distribution of sulfur in Thiobacillus ferrooxidans cells[J]. Mikrobiologiya，1983，52（3）：455-460.

[13]宫磊. 生物催化氧化法处理H2S废气的工艺及理论研究[D]. 昆明：昆明理工大学，2005：87-101.

（责编：张宏民）