南极磷虾中氟含量的两种测定方法优化与比较

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（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所食品工程与营养研究室，山东青岛 266071；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003）

南极磷虾（Euphausia superba Dana），资源蕴藏量巨大，据估计在6.5亿t～10亿t，是可供人类利用的海洋动物资源中蕴藏量最为丰富的一种，也是人类重要的后备蛋白库[1]。南极磷虾营养丰富，除富含蛋白质、必需氨基酸和亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸外，还含有钙、钾、镁、锶等多种矿物质元素，开发潜力巨大[2-4]。目前已有20多个国家正在进行南极磷虾加工工艺及生物活性物质提取的研究，其研究热点集中于南极磷虾原料的保鲜、生物活性物质的提取、虾油、虾膏及虾糜的加工工艺等[5]，但高氟含量成为开发利用的“瓶颈”。

氟是非金属中最活泼的元素，氧化能力很强，可以同绝大部分非金属元素和金属元素反应，生成氟化物。适量的氟是人体所必需的，可以与牙齿钙质生成不溶于水的氟化钙，预防龋齿。过量的氟对机体的多种组织器官及系统均有影响，会引起氟斑牙、氟骨症[6]。氟化物可以通过生物链蓄积进入人体[7]，主要积聚在骨组织（骨骼和牙齿）中[8]。世界卫生组织（WHO）提出，人均每天适宜的氟摄入量ADI值为2.5 mg～4.0 mg。国标（GB/T 5009.18-2003）《食品中氟的测定》中规定了食品中氟的三种测定方法，分别为扩散-氟试剂比色法、灰化蒸馏-氟试剂比色（ADFRC）法和离子选择电极（ISE）法[9]。谷类、果蔬、肉类、蛋类及豆制品等食品的氟含量低于5 mg/kg，南极磷虾整虾的氟含量可达1 300 mg/kg～2 400 mg/kg（干重计）[3]。因此，探讨国标中3种方法是否适用于南极磷虾中氟含量的测定具有重要意义。扩散-氟试剂比色法的方法检出限为0.10 mg/kg，所用的塑料扩散盒不易购买，样品前处理较为繁琐，检测分析周期为24 h～30 h，检测范围0.10 mg/kg～1.00 mg/kg，不适于测定高氟含量的南极磷虾样品。本文比较并优化了ADFRC法和ISE法检测南极磷虾中氟含量的操作条件，采用精密度和t检验比较两种方法检测结果的差异性，旨在筛选出适宜检测高氟含量南极磷虾样品的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

南极磷虾由辽宁省大连海洋渔业集团公司提供，-20℃冰柜中储藏。

虾膏、虾糜及虾酱均由实验室加工制作，虾膏和虾糜于-20℃冰柜中储藏，虾酱于-4℃冰柜中储藏。

虾糜的加工工艺：南极磷虾→筛分→漂洗→沥水→脱壳采肉→装盘、称重→速冻→脱盘、包冰→包装、冷藏

虾膏的加工工艺：南极磷虾→筛分→漂洗→沥水→脱壳采肉→酶解→分离→浓缩→调味杀菌→成品包装

虾酱的加工工艺：南极磷虾→筛分→漂洗→沥水→脱壳采肉→发酵→分离→浓缩→调味杀菌→成品包装

1.2 试验试剂

氟标准溶液，茜素氨羧络合剂（氟试剂），硝酸镧溶液，丙酮，缓冲液（pH4.7），硝酸镁溶液（100 g/L），氢氧化钠溶液（100 g/L），乙酸溶液（1 mol/L），酚酞-乙醇指示液（10 g/L），硫酸（2+1），盐酸溶液（1+11），总离子强度缓冲溶液（TISAB）。

所用试剂均为A.R级，依照GB/T 5009.18-2003《食品中氟的测定》配制。所用水均为双蒸水。

1.3 仪器与设备

UNICO UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；雷磁PHS-3C离子计：上海精密科学仪器有限公司；氟离子选择电极PF-1-01型：上海仪电科学仪器股份有限公司；甘汞电极232型：上海仪电科学仪器股份有限公司；分析天平：赛多利斯BSA型；pH计STARTER 3C：奥豪斯仪器有限公司；九阳料理机JYL-C020：九阳股份有限公司；快速混匀器SZ-1型：江苏金城国胜实验仪器厂；电热鼓风干燥箱101-1AB型：天津市泰斯特仪器有限公司；磁力搅拌器78-1型：常州国华电器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 ADFRC法

取100 g左右的南极磷虾鲜样，绞肉机搅碎。称取5.00 g左右南极磷虾样品于30 mL坩埚中，加5.0 mL硝酸镁溶液（100 g/L）和 0.5 mL氢氧化钠溶液（100 g/L），混匀后浸泡30 min，烘箱中105℃蒸干，低温炭化，550℃灰化6 h，干燥器中冷却。按国标GB/T 5009.18-2003《食品中氟的测定》9.3规定蒸馏，9.4规定测定。

1.4.2 ISE法

称取2.00 g左右南极磷虾样品，置于50 mL刻度管中，加入10 mL盐酸溶液，组织混匀机混匀（避免样品粘在瓶壁上），密闭浸提1 h，加入25 mLTISAB，再加水定容，混匀。氟离子选择电极和甘汞电极与测量仪器相连接。电极插入盛有双蒸水的50 mL塑料烧杯中，塑料烧杯中放有与其配套的磁力搅拌子，在电磁搅拌中，读取平衡电位值，更换2次～3次水后，待电位值平衡后，一般回升到360 mV以上，即可进行样液与标准液的电位测定。

1.4.3 数据处理与分析

分别用两种方法测定南极磷虾中的氟含量，每次3个平行，重复2次，结果以平均值X、标准偏差SD及相对标准偏差RSD表示，采用SPSS17.0进行配对样品的t检验分析，若概率P＜0.05，则差异显著；若P＞0.05，则差异不显著。

2 结果分析与讨论

2.1 ADFRC法的检测条件优化

2.1.1 最适波长的确定

以未加氟标准使用液蒸馏得到的馏出液为空白，测定 1.0 μg/10 mL 氟标准使用液在 550、560、570、580、590、600、610、620 nm 下的吸光度，结果显示波长在560 nm～590 nm之间，吸光度稳定，且在580 nm条件下，示数最快达到稳定。波长越大，吸光度值越小。虽然在550 nm吸光度较大，但是结果不稳定，有较大波动。确定波长580 nm为ADFRC法的测定波长。

图1 波长对吸光度的影响Fig.1 Effect of wavelength on the absorbance

2.1.2 样品稀释倍数对吸光度的影响

按照国标GB/T 5009.18-2003规定，以氟浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。氟浓度为0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/10mL，得到标准曲线 Y=0.012X+0.007 4，R2=0.995 2，线性范围较窄 0.1 mg/kg～2.0 mg/kg。样品经灰化蒸馏，得到蒸馏原液，其吸光度不在标准曲线线性范围内，需对样品原液进行稀释。样品原液稀释10倍、25倍、50倍，测样品吸光度，计算南极磷虾氟含量（以湿基计），每组实验三次平行，见表1。

结果显示，稀释25倍的样品浓度氟含量测定结果准确，后续试验选择样品馏出液稀释25倍。

表1 样品稀释倍数对吸光度的影响Table 1 Effect of sample dilution multiple on the absorbance

2.2 ISE法的检测条件优化

2.2.1 取样量及加酸量

采用国标ISE法测定2012年南极磷虾整虾的氟含量（以湿基计），结果见表2中A组数据，南极磷虾整虾的氟含量X为312.43 mg/kg，SD为10.622 3，样品平行性不好，需对取样量及加酸量进行优化。以取样量和加酸量作为变化参数，分别设置取样1、2、3 g，盐酸体积10、15、20 mL，得到九种试验组合，每组三次平行，研究取样量和加酸量对ISE检测方法的影响。

表2 取样量及加酸量的选择Table 2 Selection of sampling quantity and hydrochloric acid volume

样品测定时，必须用TISAB调节pH在5～6之间，以消除与氟离子形成络合物的铁、铝及硅酸根等干扰离子及酸度的影响。当添加盐酸20 mL，TISAB 25 mL，定容50 mL时，测定待测液的pH在5.0～5.2之间。当盐酸体积超过20 mL时，待测液的pH低于5.0，因此设定盐酸最大添加量为20 mL。结果显示（见表2），A、B、C三组样品平行性不好，D、E、F、G、H、I六组样品平行性均较好，测定结果均在310.18±4.075 4左右。由于南极磷虾氟含量分布不均，加大取样量可以提高样品的代表性，综合取样量与加酸量的检测结果，确定取样2 g，添加盐酸10 mL，TISAB25 mL，进行后续试验。

2.2.2 标准曲线

比较国标ISE法和标准溶液添加法的标准曲线。标准溶液添加法的标准曲线：加10 mL盐酸，25 mL TISAB，定容到 50 mL，此标准液氟浓度为 0 μg/mL；连续添加 100、200、200、200、100 μL 的 1.0 mg/mL 氟标准溶液得到浓度为 1.996 0、5.964 2、9.901 0、13.806 7、15.748 0 μg/mL的氟标准液；以电极电位为纵坐标，氟标准液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。分别用两种方法的标准曲线计算2012年南极磷虾整虾的氟含量（以湿基计），按照2.2.1优化的取样量和加酸条件进行样品测定，样品三次平行，结果见表3。

表3 标准曲线Table 3 Standard curves of two methods

采用国标法与标准溶液添加法分别绘制标准曲线，得到的曲线方程没有显著差别，均具有良好的线性相关性（R2＞0.999）。南极磷虾氟含量，国标法测定结果（308.78±2.588 7）mg/kg，RSD 为 0.838 4；标准溶液添加法测定结果（304.47±2.651 7）mg/kg，RSD 为 0.870 9。与国标方法相比，采用标准溶液添加法，操作简单，节省时间及试剂，同时也减小误差，因此确定采用标准溶液添加法绘制标准曲线。

2.3 两种方法测定结果差异性分析

分别采用优化后的ADFRC法和ISE法测定2012年南极磷虾中的氟含量（以湿基计）。取3个样，每组6次平行，见表4。

表4 两种测定方法的精密度比较Table 4 Precision comparison of the two methodsmg/kg

结果显示，ADFRC法测定样品氟含量306.63mg/kg～311.73 mg/kg，ISE法测定样品氟含量304.93 mg/kg～306.64 mg/kg，数据均在（306.62±2.620 2）mg/kg。两种方法相比，ADFRC法SD较大，RSD在5.9879%～9.2794%之间，样品平行性不好；ISE法SD较小，RSD在0.4123%～0.903 1%之间，样品平行性较好。

2号样品的氟含量在三组样品的测定结果中标准差及相对标准偏差均居中，取其测定结果进行配对样品 t检验，见表 5、6。

表5 两种测定方法的结果比较Table 5 Comparison of the results of two methods mg/kg

表6 配对样品t检验Table 6 Paired t-test of samples

结果显示，双尾概率P=0.681大于0.05，表明两种方法测定南极磷虾整虾的氟含量不存在显著性差异。结合表5，ISE法的SD值（2.507 3）明显低于ADFRC法的SD值（20.071 4），表明ISE法的样品平行性较好，因此确定采用ISE法测定南极磷虾制品中的氟含量。

2.4 南极磷虾及其制品中氟含量的测定

采用ISE法测定2012年南极磷虾各部位及其制品中的氟含量，见表7。

表7 南极磷虾及其制品中氟含量（湿重）Table 7 Fluorine content of Antarctic krill and its products（wet weight） mg/kg

结果显示，南极磷虾中的氟含量的分布具有甲壳＞头部＞肌肉的变化特征，与文献报道一致[10]。虾膏及虾酱加工过程中去掉虾头，虾糜加工不去虾头，致使虾膏及虾酱中氟含量低于虾糜。在加工过程中去掉甲壳及头部可降低南极磷虾制品中的氟含量。

3 结论

本文分别对两种方法的检测条件进行优化，确定ADFRC法的测定波长为580 nm，样品馏出液稀释25倍测定样品中氟含量；确定ISE法取样2g，加盐酸10mL，浸提1 h，加TISAB 25 mL，定至50 mL，采用标准溶液添加法绘制标准曲线，测定样品中氟含量。两种测定方法相比，ADFRC法操作复杂繁琐，需配制硫酸、盐酸、氢氧化钠、硝酸镧、茜素氨羧络合剂等大量试剂，样品经前处理后和系列氟标准都需逐一蒸馏，费时费力，对操作人员要求相对较高，不适宜大批样品的测定[11]；ISE法只需配制总离子强度缓冲液和盐酸溶液，操作简便省时，适合大批量样品的快速测定。ADFRC法的检出限是 0.10 μg/mL[9]，ISE 法的检出限 0.02μg/mL[12]。与ADFRC法相比，ISE法样品平行性好，检测范围更宽，可以测定水、血液及尿中氟含量（1.0 μg/mL），也可测定南极磷虾干粉中氟含量（2 518.6 mg/kg）[13]。

应用ISE法测定南极磷虾各部位及虾糜、虾膏及虾酱中氟含量。结果显示，南极磷虾各部位中氟含量的分布具有甲壳>头部>肌肉的变化特征，在加工过程中去掉甲壳及头部可降低南极磷虾制品中的氟含量。

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