响应面法优化灵芝子实体三萜提取工艺的研究

洪文龙，童斌，赵格

（江苏农林职业技术学院，江苏 镇江212400）

1982年Kubora.T等首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物。灵芝三萜是一个大的统称，又称为灵芝三萜类或总三萜[1]。三萜类（Trierponoides），以四环三萜化合物为主，具有抗癌、促进肝功能、抗过敏、抗炎止痛之功效。灵芝中三萜含量很高，而其它药用植物含量则很少。其他植物中也含有三萜类，但是灵芝所含有的特殊三萜类（或称“灵芝酸”），为其他植物所没有[2]。三萜类灵芝酸为保护肝功能的主要成分，具有强烈的药理活性，有护肝、解毒和止痛等功能。如灵芝酸A、B、C和D能抑制细胞组织胺的释放，灵芝酸F有很强烈的抑制血管紧张素酶的活性，灵芝酸R和S有强烈的抗病毒能力[3]。

试验通过有机溶剂加以超声波辅助提取的方法研究了灵芝子实体三萜的提取方法，采用超声提取工艺，缩短了提取时间、降低了提取温度，其原因是超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，都可加速有效成分进入溶剂，从而提高了提出率，缩短了提取时间，并且免去了高温对提取成分的影响，对传统的提取手段有了较大改进[4]。

1 材料与设备

1.1 材料

赤灵芝纯子实体超细粉：上海市农业科学院上海菇宝食用菌有限公司；标准齐墩果酸：上海金穗生物科技有限公司（≥98%）；95%乙醇、5%香草醛-冰乙酸、高氯酸、冰醋酸等：上海国药试剂公司，为分析纯。

1.2 设备

G＆G/双杰JJ224BC型电子天平：UV-2100型紫外可见分光光度计；KQ3200 E型超声波清洗器；HHS型电热恒温水浴锅。

2 原理和操作方法

2.1 原理

三萜类物质溶于有机溶剂，加入5%香草醛－冰醋酸溶液和高氯酸混匀，用三萜类化合物在加热的条件下可以和香草醛－高氯酸试剂发生显色反应，在550 nm处有最大吸光度，根据绘制的标准曲线计算三萜含量。

2.2 灵芝三萜提取过程

齐墩果酸标准曲线的绘制→样品超声提取→过滤后弃初滤液→分光光度法测吸光度→根据标准曲线方程计算三萜提取率。

2.3 齐敦果酸标准曲线的绘制

精确称取齐墩果酸标准样品17 mg，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度。分别吸取标准溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于试管中，另取 0 号试管加入无水乙醇1 mL，将所有试管置于沸水浴中挥去溶剂，加5%香草醛-冰乙酸0.3 mL，高氯酸1.0 mL，迅速用混合仪混均溶液。再将试管置于70℃水浴中加热15 min，拿出用冰水冷却至室温，冰醋酸定容至10 mL，迅速混匀溶液，在550 nm处测定吸光值，以吸光度为纵坐标，以齐墩果酸微克数为横坐标作标准曲线，根据齐墩果酸的含量（μg）和吸光值（A）的关系，建立线性回归方程[5]，见图1。

图1 齐墩果酸标准曲线Fig.1 Oleanolic acid standard curve

建立线性回归方程：Y=0.055 X-0.009 4，R2=0.999 3。

2.4 样品灵芝三萜得率测定

准确称取一定量1.0 g样品，加乙醇进行超声处理，样液加乙醇定容至100 mL，摇匀，过滤，弃去初滤液，收集滤液，吸1 mL滤液于试管中，参比管加1 mL无水乙醇。用测定标准工作曲线的方法，测定样品在550 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算出相应的三萜含量，根据公式计算样品三萜含量。

3 结果与分析

3.1 单因素变量试验

实验选择95%乙醇、超声频率（50 Hz）为定量，检测含量试验条件一致[6]。以超声温度、时间、料液比为变量进行单因素试验，验证分析各个单因素变量对提取率的影响及相互关系。

3.1.1 不同超声时间对三萜化合物提取率的影响

称取1.0 g的灵芝粉5份，分别于100 mL容量瓶中，按料液比1∶20分别加人95%，在60℃条件下，超声频率 50 Hz，提取时间分别为 30、40、50、60 min。提取后，样液加乙醇定容至100 mL，摇匀，过滤，弃去初滤液，收集滤液，吸1 mL滤液于试管中，参比管加1 mL无水乙醇。用测定标准工作曲线的方法，测定样品在550 nm处测定吸光值，见图2。

图2 超声时间对三萜化合物提取率的影响Fig.2 Ultrasonic time on the extraction rate of three terpene compounds

图2 可以看出随着时间的增加，其提取率的变化很明显，提取率先升后降，相同条件下，当超声处理时间为50 min时，提取效果最好。

3.1.2 不同料液比对三萜化合物提取率的影响

称取1.0 g的灵芝粉5份，分别于100 mL容量瓶中，分别按料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加人 95%乙醇，在60℃条件下，超声频率50 Hz，提取时间分别为50 min。提取后，样液加乙醇定容至100 mL，摇匀，过滤，弃去初滤液，收集滤液，吸1 mL滤液于试管中，参比管加1 mL无水乙醇。用测定标准工作曲线的方法，测定样品在550 nm处测定吸光值，见图3。

图3 料液比对三萜化合物提取率的影响Fig.3 Effects of ratio of material to liquid on the extraction rate of three terpene compounds

图3 可以看出随着料液比的增加，其提取率的变化很明显，提取率先升后降，相同条件下，当料液比为1∶20时，提取效果最好。

3.1.3 不同温度对三萜化合物提取率的影响

不同温度对三萜化合物提取率的影响，见图4。

图4可以看出随着提取温度的增加，其提取率的变化很明显，提取率先升后降，相同条件下，当处理温度为50℃时，提取效果最好。

3.2 响应面法优化实验

图4 温度对三萜化合物提取率的影响Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of three terpene compounds

根据Box-Benhnken的中心组合设计实验原理，综合单因素影响试验结果，选取超声温度、超声时间、料液比对灵芝三萜提取率的影响，在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行实验设计[7]，分析因素见下表1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factor and levels of RSM experiment

在单因素试验基础上，用上表设计的三因素三水平方式分别进行17组实验，以提取率为考察指标，确定最佳提取工艺，实验设计及实验结果见表2。

建立模型方程与显著性检验应用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合分析，得到灵芝总三萜得率与超声提取各因素变量的二次方程模型为：

提取率（%）=1.27+0.040A+0.023B+0.019C+2.0× 10-3AB+3.25×10-3AC+0.016BC-0.088A2-0.054B2-0.043C2

表2 Box-Benhnken试验设计方案及影响值Table 2 Program of Box-Behnken experimental design and response value

从表3可以看出，由模型上F值大小可知，三因素对响应值的影响为：A＞B＞C，由P值的大小可以判断三因素均为极显著，同时也可看到方程的一次项、二次项、交互项均达到显著水平，自变量和应变量之间不是简单的线性关系，说明方程的拟合是较充分的[8]。

模型中F=82.303（P＜0.000 1），失拟项检验F=4.828（P=0.081 2＞0.05），沟通无布局说明用上述回归方程描述各因素之间的关系时，其因变量与全体自变量的线性关系显著、可靠。可用该模型对灵芝三萜的提取率进行分析和预测。

相应面曲面分析的图形是特定的响应值对应变量构成的一个三维空间图，可以直观地反映此处各自自变量对响应变量的影响，运用软件分析实验数据得到响应面图，分别如下。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Results of variance analysis for regression equantion

图5 提取时间与温度对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time and temperature on extraction rate

由图5可以看出在料液比为1∶20时，提取温度和时间对提取率的交互影响，随着提取温度的增加，提取率先升后降，随着提取时间的增加，提取率也是先升后降，同时可以看出在温度为50℃，时间为50 min时，交界处附近有极值。

图6 提取时间与温度对提取率影响的等高线Fig.6 Contour extraction time and temperature on extraction rate

由图6的等高线图可以看出两者间的交互作用呈现曲线而不是直线，说明两者之间的交互作用是显著的。

图7 料液比与提取温度对提取率的影响Fig.7 Liquid ratio and extraction temperature on extraction rate

由图7可以看出在提取时间为50min时，提取温度和料液比对提取率的交互影响，随着提取温度的增加，提取率先升后降，随着料液比的增加，提取率也是先升后降，同时可以看出在温度为50℃，料液比为1：20时，交界处附近有极值。

图8 料液比与提取温度对提取率影响的等高线Fig.8 The material liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of contour

由图8的等高线图可以看出两者间的交互作用呈现曲线而不是直线，说明两者之间的交互作用是显著的。

图9 料液比与提取时间对提取率影响Fig.9 The material liquid ratio and extraction time on the extraction rate of contour

由图9可以看出在提取温度为50℃，时，提取时间和料液比对提取率的交互影响，随着提取时间的增加，提取率先升后降，随着提取料液比的增加，提取率也是先升后降，同时可以看出在提取时间为50 min时，料液比为1∶20时，交界处附近有极值。

图10 料液比与提取时间对提取率影响的等高线Fig.10 The ratio of material to liquid and extraction time on the extraction rate of contour

由图10的等高线图可以看出两者间的交互作用呈现曲线而不是直线，说明两者之间的交互作用是显著的。

4 结论

对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个主要因素的最佳水平值，分别为：A=0.00，B=0.00，C=0.00，转换后得到提取的最佳条件为：提取温度为50℃，提取时间50 min，料液比为1∶20，预测灵芝三萜提取率为1.27%。通过软件可看出实际与预测的提取率较为接近，说明该模型适用于灵芝三萜提取工艺的优化。

[1]张晓云,杨春清.灵芝的化学成分和药理作用国外医药[J].植物药分册,2006,21(4):152

[2]王维源.灵芝的药用价值[J].今日科技,2007(22):35-36

[3]冯道俊.灵芝的化学成分、功效及药理作用[J].特种经济动植物,2006(8):39-40

[4]胡涛,王亚亚,路春桃,等.超声波辅助提取桦褐孔菌子实体中三萜类化合物的研究[J].安徽农业科学,2011(35):21634-21635

[5]徐秀泉,田明月.响应面优化桦褐孔菌总三萜超声提取工艺[J].食品科技,2011(10):181

[6]姚松君,黄生权.超声辅助提取灵芝三萜的工艺研究[J].现代食品科技,2009(10):1220-1221

[7]刘健,郭淑英.响应曲面法提取苦白蹄中总三萜成分[J].吉林医药学院学报,2011(10):279

[8]陈君琛,赖谱富.响应面法优化大球盖菇粗多糖提取工艺[J].食品科学,2012(1):143-144