三个水稻凝集素类受体蛋白激酶基因的表达活性分析

刘 冰，淡沐春，丁彩琴，侯 芳，陈吴方，杨晓坡,2

（1.赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000；2.山西大学 科学技术哲学研究中心，山西 太原 003006）

三个水稻凝集素类受体蛋白激酶基因的表达活性分析

刘 冰1，淡沐春1，丁彩琴1，侯 芳1，陈吴方1，杨晓坡1,2

（1.赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000；2.山西大学 科学技术哲学研究中心，山西 太原 003006）

凝集素类受体蛋白激酶基因LecRK在植物生长发育、机械损伤和抵抗逆境等应答过程中发挥着重要作用.本文以不同生长条件和不同组织的水稻为材料，针对OsLecRK-Ⅲ.1等三个水稻凝集素类受体蛋白激酶基因的表达活性进行了研究，为水稻LecRK家族的功能研究奠定了基础.

水稻；凝集素类受体蛋白激酶；差异表达

植物凝集素类受体蛋白激酶(LecRK)是在拟南芥中首次发现的，目前对其研究已取得一定进展.Song等(1995)研究发现转抗病激酶Xa21的水稻植株具有明显的白叶枯病抗性[1].研究显示，拟南芥LecRK亚家族部分成员在花器官的生长发育过程中发挥着重要作用，CLV1蛋白的表达与花器官的分生组织形成密切相关，HAESA蛋白的表达与花器官的脱落密切相关，而SGC蛋白在花粉的发育过程中发挥了重要功能[2-4].拟南芥AtLecRK2基因可通过盐胁迫被诱导[5]. Xin等（2009）发现拟南芥A4蛋白在种子萌发过程中对脱落酸（abscisicacid，ABA）应答具有负调控的作用[6].拟南芥LecRK-I.9蛋白在茄科植物中的过量表达使得植株对疫病菌具有较好的抗性[7].综上所述，LecRK家族有可能在植物生长发育、机械损伤和抵抗逆境等应答过程中起到重要作用.本文针对水稻凝集素类受体蛋白激酶基因OsLecRK-Ⅲ.1 (Os03g15250)、OsLecRK-V.2（Os05g3450）和OsLecRK-Ⅺ.1（Os11g25860）的表达活性进行了研究与分析.

1 试验材料

供试水稻为日本晴（O.Sative.L.JaponicNippanbare.）.本实验所使用的rTaq酶等为TaKaRa生物公司产品.

2 试验方法

2.1 水稻总RNA的提取及cDNA的扩增

将所提取的RNA置于冰盒上，引物、10×RTmix、超纯dNTP混合液、Nase-freeddH2O在室温（15~25℃）解冻后迅速置于冰上.20μL逆转录反应体系如下：10×RTmix2μL、超纯dNTP2μL、Random（10μM）2μL、QuantReverse Transcriptase1μL、RNase-freeH2O8μL、模板RNA5μL.反应条件为37℃孵育60min.

2.2 RT-PCR反应及电泳检测

引物由Invitrogen公司合成,序列如下：OsLecRK-Ⅲ. 1-F：5’-AGCGCCGATCACAGGT-3’；OsLecRK-Ⅲ.1-R：5’-GTCTCGGTGGATGACTACTTTC-3’；OsLecRK-V.2-F：5’-GAGAAGACACTGAGCGACTAC-3’；OsLecRK-V.2-R：5’-GGATAGCGACGAGTGTCA-3’；OsLecRK-Ⅺ.1-F：5’-GT CTCTCTCACTTCCCCCT-3’；OsLecRK-Ⅺ.1-R：5’-GCCGCC ATAGCCGTTG-3’.OsLecRK-Ⅲ.1扩增程序如下：94℃5 min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，35个循环；72℃5 min；4℃保存.OsLecRK-V.2扩增程序如下：94℃5min；94℃45s,57℃40s，72℃40s，32个循环；72℃5min；4℃保存.OsLecRK-Ⅺ.1扩增程序如下：94℃5min；94℃40s，59℃30s，72℃35s，32个循环；72℃5min；4℃保存.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后于凝胶成像分析系统下观察并照相.

3 结果与分析

3.1 水稻总RNA电泳分析

正常条件下水稻根、茎、叶、愈伤组织及黑暗条件下水稻根、茎、叶的RNA电泳图谱如图1、图2.

图1 正常条件下水稻总RNA电泳图谱

图2 黑暗条件下水稻总RNA电泳图谱

3.2 水稻OsLecRK-Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因保守序列的RT-PCR扩增

琼脂糖凝胶电泳分析表明，OsLecRK-Ⅲ.1在正常水稻的根、茎、叶、愈伤以及黑暗条件下水稻的茎和叶中均获得了大小约为560bp的目的片段（图3），OsLecRK-V.2在正常水稻的根、茎、叶、愈伤以及黑暗条件下水稻的茎和叶中均获得了大小约为448bp的目的片段（图4），OsLecRK-Ⅺ.1在正常水稻的根、叶、愈伤以及黑暗条件下水稻的根和叶中均获得了大小约为340bp的目的片段（图5）.水稻OsLecRK -Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在不同组织中的表达情况如表1所示.

图3 水稻OsLecRK-Ⅲ.1基因保守序列RT-PCR扩增产物

图4 水稻OsLecRK-V.2基因保守序列RT-PCR扩增产物

图5 水稻OsLecRK-Ⅺ.1基因保守序列RT-PCR扩增产物

表1 OsLecRK-Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因差异表达情况

4 讨论与结论

由RT-PCR表达分析的结果可知，水稻OsLecRK-Ⅲ. 1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在不同植物组织和培养条件下均存在一定程度的差异表达（differential expression）.Bouwmeester等（2009）在基因组水平上对拟南芥L型LecRK进行了分类与表达活性分析[8].通过与拟南芥L型LecRK基因表达谱进行比较发现，OsLecRK-Ⅲ.1和OsLecRK-V.2与LecRK-I.4（At3g45420）、LecRK-V.1（At1g 70110）、LecRK-S.3（At3g46760）等基因在表达特征上有一定的相关性，而OsLecRK-Ⅺ.1与LecRK-Ⅳ.3(At4g02410)在表达特征上基本相同，因此推断彼此在相似的发育阶段或生长条件下可能具有相似的功能.本文对水稻OsLecRK-Ⅲ. 1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在植物不同组织及不同生长状态下表达活性的分析，为水稻LecRK家族的功能研究奠定了基础.

〔1〕SongWY,WangGL,Chen LL,etal.Areceptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21[J].Science,1995,270:1804-1806.

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〔6〕XinZ,WangA,YangG,etal.TheArabidopsisA4 subfamilyofLectinreceptorkinasesnegativelyregulates abscisicacid responsein seed germination [J].Plant Physiol,2009,149:434–444.

〔7〕BouwmeesterK,HanM,Blanco-PortalesR,etal.The ArabidopsislectinreceptorkinaseLecRK-I.9enhances resistancetoPhytophthorainfestansinSolanaceousplants [J].PlantBiotechnologyJournal.2014,12:10–16.

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Q78；Q943

A

1673-260X（2014）12-0011-02

内蒙古自治区教育厅高等学校科学研究项目（NJSY11219）