金樱子通过增加Bcl-2/Bax表达比抑制大鼠糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡△

周俊 何湘珍 肖启国

金樱子通过增加Bcl-2/Bax表达比抑制大鼠糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡△

周俊 何湘珍 肖启国

金樱子；糖尿病性白内障；凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

目的探讨金樱子对糖尿病性白内障大鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)凋亡的影响及机制。方法将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组各20只。对照组常规饲料喂养，采用链脲佐菌素(60 mg·kg-1)诱发建立糖尿病性白内障模型，治疗组在糖尿病性白内障建立的同时按400 mg·kg-1体质量给予金樱子灌胃。STZ注射后4周、8周、12周时观察晶状体混浊度的变化情况,同时采用TUNEL检测LEC凋亡，免疫组织化学染色检测LEC Bcl-2、Bax蛋白的表达，RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因的表达。结果STZ注射后12周时，模型组、治疗组和对照组大鼠体质量分别为(151.90±2.38)g、(412.99±2.17)g和(464.01±2.47)g，模型组明显低于治疗组和对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。STZ注射后4周时，治疗组、对照组、模型组血糖分别为(9.11±2.32)mmol·L-1、(3.83±0.79)mmol·L-1、(20.31±3.23)mmol·L-1，对照组与模型组、治疗组与模型组间差异均有统计学意义(均为P<0.05);12周时，治疗组和对照组血糖分别为(5.62±1.25)mmol·L-1、(4.12±1.09)mmol·L-1，较模型组(25.02±2.27)mmol·L-1明显下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。在STZ注射后4周、8周、12周时，治疗组大鼠晶状体混浊程度均高于对照组，但明显低于模型组，组间两两比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。STZ注射后4周、8周、12周时，模型组LEC凋亡率分别为(8.35±1.20)%、(13.05±1.39)%、(23.69±1.88)%，而治疗组分别为(4.78±1.41)%、(6.08±0.95)%、(10.06±1.66)%，对照组分别为(1.18±0.16)%、(2.15±0.25)%、(3.53±0.65)%,组间两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组比较，模型组LEC的Bcl-2蛋白和基因表达降低，Bax蛋白和基因表达上调，Bcl-2/Bax mRNA比值下降,两组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与模型组比较，治疗组LEC的Bcl-2蛋白和基因表达增加，Bax蛋白和基因表达下调，Bcl-2/Bax mRNA比值明显增加，两组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组比较，治疗组Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(P<0.05);而Bcl-2基因、Bax基因、Bcl-2/Bax mRNA比值差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论金樱子通过增加Bcl-2/Bax表达比抑制大鼠糖尿病性白内障LEC的凋亡，延缓糖尿病性白内障的发生和发展。

[眼科新进展，2014，34(4)：314-318]

糖尿病性白内障是糖尿病患者常见的并发症之一，也是常见的致盲原因之一[1]。在白内障的发生和发展过程中晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)凋亡的程度至关重要。金樱子又名刺榆子、山鸡头子等，是双子叶常绿攀缘植物，属蔷薇科，在我国分布广泛，产量高。有研究显示金樱子能明显清除超氧阴离子自由基、羟自由基，抑制凋亡，能防止脂质过氧化，调节血糖及血脂，具有明显的抗氧化活性和抗炎作用[2]。本研究拟初步探讨金樱子对大鼠糖尿病性白内障LEC凋亡的影响及其机制，为防治糖尿病性白内障寻找新的方法。

1 材料和方法

1.1材料与分组SD大鼠购自南华大学实验动物部，经散瞳实验检查显示晶状体正常、透明，大鼠体质量(250±5)g。将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组各20只。金樱子购自衡阳市中草药材公司；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma公司；TUNEL检测试剂盒、Bcl-2和Bax抗体购自武汉博士德生物工程公司；其余试剂购自上海生物工程有限公司。采用Primer 5.0软件设计引物,由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠白内障模型的建立及金樱子处理对照组常规饲料喂养；模型组采用一次性腹腔注射STZ(60 mg·kg-1)诱发建立糖尿病性白内障模型，72 h后尾静脉取血，当空腹血糖>14 mmol·L-1表示糖尿病模型建立成功；治疗组在糖尿病性白内障模型建立的同时按400 mg·kg-1体质量给予金樱子灌胃。观察大鼠的一般情况并称体质量，记录并调整金樱子药物用量。分别于STZ注射后于4周、8周时各组随机处死5只大鼠，共30只；12周时处死剩余30只大鼠。采用戊巴比妥钠麻醉处死，取晶状体用于后述研究。

1.2.2晶状体混浊度的检测10 g·L-1托品酰胺滴眼液滴大鼠双眼一次，5 min后大鼠吸入乙醚蒸气麻醉。4周、8周、12周时用TOPCON SL-2G裂隙灯显微镜观察晶状体变化并拍照，晶状体混浊程度按照文献[4]的标准分为5级：Ⅰ级：无混浊，晶状体透明；Ⅱ级：轻度混浊，晶状体周边出现空泡；Ⅲ级：中度混浊，晶状体周边空泡向中心扩展，核出现雾状混浊；Ⅳ级：高度混浊，晶状体周边空泡扩展到核区，核雾状混浊加重；Ⅴ级：核混浊，白内障成熟。

1.2.3TUNEL检测细胞凋亡金樱子处理12周后，将各组动物晶状体常规取出，立即用体积分数10%中性甲醛液固定，制成石蜡切片(0.4 μm厚)，然后按照试剂盒说明书进行操作。每个晶状体标本选3张切片，Olympus BH-2型显微镜观察，统计凋亡细胞率。凋亡阳性细胞的细胞核呈棕黄色、棕褐色。

1.2.4免疫组织化学染色检测Bcl-2和Bax蛋白的表达将石蜡切片常规脱蜡、水化后， 体积分数30% H2O2和蒸馏水110混合，室温下孵育10 min，用蒸馏水冲洗3次，每次5 min；切片浸入0.01 mmol·L-1枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，加热致沸腾5～10 min，冷却后PBS冲洗3次，每次3 min；每张切片加1滴50 g·L-1BSA封闭液，室温下孵育20 min，甩去多余液体；滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；再滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加试剂SABC,37 ℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min；用新鲜配制的DAB显色液显色，显微镜下观察2～5 min；自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用图像分析系统(Leica ICM-100图像分析仪)分析Bcl-2和Bax蛋白的相对含量。

1.2.5RT-PCR检测Bcl-2和Bax基因的表达用Trizol试剂提取晶状体RNA，并逆转录成cDNA。反应体系：10×Tag缓冲液2.50 μL,25.0 mmol·L-1MgCl21.50 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.00 μL、上下游引物各1 μL(引物序列为：Bcl-2：S：CCGGGAGAACAGGGTATGA，AS：CCTACCCAGCCTCCGTTAT；Bax:S: AGATGAACTGGACAGCAATATG，AS: CACCCCTCCCAATAATTACA；β-actin:S: ACCGTGGAGAAGAGCTACGA，AS: GTACTTGCGCTCAGAAGGAG),cDNA模板2.00 μL,重蒸水14.75 μL，Tag酶0.25 μL。94 ℃预变性3 min后，进入31个循环:96 ℃ 50 s,55 ℃ 50 s,70 ℃ 50 s，最后72 ℃延伸10 min。取10.00 μL进行琼脂糖凝胶电泳与灰度扫描分析。

2 结果

2.1糖尿病大鼠的一般情况模型组和治疗组大鼠自STZ注射后7 d饮水、进食、尿量明显增加。对照组大鼠随时间延长体质量增长迅速，模型组大鼠体质量增长较快，而治疗组大鼠体质量缓慢增长。4周时模型组大鼠一般状况变差，体质量下降，毛发失去光泽、脱毛，中后期逐渐出现糖尿病症状和并发症(如消瘦和多发感染)，而治疗组体质量明显较模型组增加，一般状况明显较模型组好；对照组情况良好。STZ注射12周时模型组、治疗组、对照组大鼠体质量分别为(151.90±2.38)g、(412.99±2.17)g、(464.01±2.47)g，模型组明显低于治疗组和对照组(均为P<0.05)，对照组与治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组大鼠的血糖值检测注射STZ前大鼠(40只)空腹血糖为(3.86±0.35)mmol·L-1，用STZ诱发后3 d，40只大鼠空腹血糖为(15.22±1.21)mmol·L-1，均为造模成功(空腹血糖>14 mmol·L-1)。STZ注射后4周，对照组、模型组、治疗组大鼠血糖分别为(3.83±0.79)mmol·L-1、(20.31±3.23)mmol·L-1、(9.11±2.32)mmol·L-1，组间两两比较比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。至12周时，模型组、治疗组、对照组血糖分别为(25.02±2.27)mmol·L-1、(5.62±1.25)mmol·L-1、(4.12±1.09)mmol·L-1，治疗组血糖较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组与治疗组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3晶状体混浊的程度三组大鼠晶状体混浊程度见表1。模型组、治疗组均于STZ注射后4周晶状体出现不同程度的混浊(P<0.05)，并随着时间的推移，晶状体混浊程度不断加重。至8周时，治疗组的晶状体混浊程度较模型组轻。至12周时，模型组的晶状体全部出现了不同程度的混浊，已无1例Ⅰ级透明的晶状体，而治疗组的晶状体混浊发展程度明显减慢。4周、8周、12周对照组的晶状体至始至终无1例发生混浊。各时间点治疗组的晶状体混浊度均低于模型组，三组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.4各组大鼠细胞凋亡率三组大鼠LEC凋亡情况见表2。各时间点对照组大鼠LEC几乎无凋亡，模型组LEC凋亡率明显高于对照组，治疗组LEC凋亡率明显低于模型组，治疗组LEC凋亡率虽然明显降低，但仍高于对照组；各时间点组间两两比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

表1 各时间点三组大鼠晶状体混浊程度Table 1 Lens opacity degree among three groups at different time points(rats)

表2 各组大鼠LEC的凋亡率Table 2 Apoptotic ratio of LEC in each group(rate/%)

2.5Bcl-2、Bax蛋白表达情况三组大鼠Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达情况见表3-表4。正常大鼠LEC均有一定量Bcl-2、Bax的表达，胞浆内棕黄色颗粒沉淀，胞核均呈阴性染色。STZ注射4周、8周、12周时模型组Bcl-2蛋白阳性表达均较对照组下降(均为P<0.05)，同一时间点模型组Bax蛋白阳性表达均增强(均为P<0.05)。4周、8周、12周时治疗组Bcl-2蛋白阳性表达均高于模型组(均为P<0.05)，同一时间点Bax蛋白阳性表达均低于模型组(均为P<0.05)。4周、8周、12周时治疗组Bcl-2蛋白的表达均低于对照组(均为P<0.05)，而同一时间点治疗组Bax蛋白的表达均高于对照组(均为P<0.05)。

表3 各组大鼠LEC中Bcl-2蛋白表达Table 3 Expressions of Bcl-2 protein in LEC of each group(±s,n=20)

表4 各组大鼠LEC中Bax蛋白表达Table 4 Expression of Bax protein in LEC of each group(±s,n=20)

2.6Bcl-2与Bax基因表达情况三组大鼠Bcl-2、Bax基因表达情况见表5。正常大鼠LEC Bcl-2和Bax基因均有表达。模型组Bcl-2 mRNA的相对表达量明显低于对照组(P<0.05)，Bax mRNA的相对表达量明显高于对照组(P<0.05),Bcl-2/Bax mRNA比值减小，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组Bcl-2 mRNA的相对表达量明显高于模型组(P<0.05)，Bax mRNA的相对表达量明显低于模型组(P<0.05)，Bcl-2/Bax mRNA比值增大，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组Bcl-2 mRNA的相对表达量和Bax mRNA的相对表达量均略低于对照组，但Bcl-2/Bax mRNA比值略增大，两组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

表5 各组大鼠LEC中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达Table 5 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA in LEC of each group(±s,n=20)

3 讨论

随着我国人民生活水平的提高和受不健康的生活方式的影响，糖尿病已成为影响我国国民健康的常见疾病[3]。糖尿病性白内障的特点是皮质和后囊膜下混浊，进展较快，常常双眼同时发病，是糖尿病患者致盲的一个重要原因。LEC凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础。

已有研究证实[4]，当血糖值超过10 mmol·L-1时，糖基化反应速率与白内障晶状体混浊呈指数级增加，糖尿病性白内障中糖基化终产物在细胞内累积使晶状体混浊，颜色加深。LEC是晶状体代谢最活跃的部位，它能分裂、增殖于赤道部，产生晶状体纤维并维持整个晶状体的代谢，在保持晶状体的透明性上起重要作用，而在晶状体混浊前均有LEC凋亡，因此LEC凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础[5]。LEC是糖尿病性白内障最早受累的位点，高糖产生的高氧化、高渗透压等损害因子能以LEC为攻击目标，诱导它发生凋亡而丧失功能，并由此产生级联反应，破坏晶状体的稳定，如钙离子渗入、半胱氨酸酶激活、细胞骨架降解、晶状体蛋白变性聚集、水和电解质进入等，最终导致晶状体混浊[6]。在糖尿病性白内障中LEC能自主地发现凋亡并进行调整从而阻止过度凋亡，在高血糖这种外源性病理因素的刺激下，LEC凋亡和增殖的平衡关系被打破而导致LEC凋亡，晶状体内环境代谢失衡，最终导致白内障发生[7]。而高血糖及并发的细胞高渗状态可改变Bcl-2、Bax等凋亡调控基因的表达，诱导细胞凋亡的发生[8]。我们在实验中发现，模型组晶状体混浊程度均明显高于对照组，而治疗组则明显轻于模型组(表1)。同时模型组LEC凋亡率明显高于对照组,而治疗组的凋亡率较模型组低，且发生时间晚。再次证实糖尿病性白内障随着晶状体混浊程度逐渐加重，LEC凋亡的程度亦加重，而经过金樱子处理后的大鼠，LEC凋亡水平明显低于模型组，说明金樱子能在一定程度上抑制或延缓凋亡的发生。

Bcl-2家族是最早研究的凋亡相关基因，其中Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用。Bcl-2/Bax在凋亡通路上发挥重要作用，决定了凋亡调控的方向，是研究细胞凋亡关系的热点基因[9]。它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控，当细胞受到死亡信号刺激，与Bcl-2或Bcl-xl蛋白相结合的Bax蛋白就会被置换出来，线粒体膜通透性增加，释放出一系列物质，最终导致细胞死亡。Bcl-2为抑制细胞凋亡的基因，通常以二聚体的形式在细胞凋亡中发挥作用。在细胞内，Bcl-2和Bax可以分别形成同二聚体，也可以互相形成异二聚体。当细胞接受某些刺激信号后，如果Bcl-2过表达，形成Bcl-2/Bax异二聚体增加，细胞免于凋亡；如果Bax过表达，形成Bax/Bax同二聚体增加，则促进细胞发生凋亡。有研究证实在大鼠糖尿病性白内障中对LEC凋亡的抑制作用可能是通过改变Bcl-2/Bax的比值而实现的[10]。本研究结果显示，模型组与对照组相比，Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA降低，Bax蛋白和Bax mRNA升高，Bcl-2/Bax mRNA比值下降，表明Bcl-2和Bax表达水平的改变在糖尿病性白内障LEC凋亡过程中发挥了重要的作用。治疗组的Bcl-2 /Bax mRNA表达比值较模型组则明显增高，结果提示金樱子可能通过提高Bcl-2 /Bax表达比值而抑制LEC凋亡。

总之，金樱子具有一定的抗LEC凋亡的能力，可能对大鼠糖尿病性白内障有一定的延缓和治疗作用，其作用机制可能是通过增强Bcl-2的表达、降低Bax的表达来实现的，但其全面的、具体的机制尚有待进一步研究。

1 Balakumar M,Saravanan N,Prabhu D,Regin B,Reddy GB,Mohan V,etal.Benefits of early glycemic control by insulin on sensory neuropathy and cataract in diabetic rats [J].IndianJExpBiol,2013,51(1):56-64.

2 Zhang S,Zheng L,Dong D,Xu L,Yin L,Qi Y.Effects of flavonoids from Rosa laevigata Michx fruit against high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in rats [J].Foodchemistry,2013,141(3):2108-2116.

3 廖霓，符松，王献民，周芹，熊梓宏，郭永宏，等.血糖控制对青少年1型糖尿病左心室结构和功能的影响[J].中华实用儿科临床杂志,2013,28(13):980-982.

4 Bahmani F,Bathaie SZ,Aldavood SJ,Ghahghaei A.Glycine therapy inhibits the progression of cataract in streptozotocin-induced diabetic rats [J].MolVis,2012,18:439-448.

5 Kim J,Kim OS,Kim CS,Sohn E,Jo K,Kim JS.Accumulation of argpyrimidine,methylglyoxal-derived advanced glycation end product,increasesapoptosis of lens epithelial cellsboth in vitro andinvivo[J].ExpMolMed,2012,44(2):167-175.

6 Li Y,Jia Y,Zhou J,Huang K.Effect of methionine sulfoxide reductase B1 silencing on high-glucose-induced apoptosis of human lens epithelial cells [J].LifeSci,2013,92(3):193-201.

7 Kumari SS,Eswaramoorthy S,Mathias RT,Varadaraj K.Unique and analogous functions of aquaporin 0 for fiber cell architecture and ocular lens transparency.Biochimica et biophysica acta[J].BiochimBiophysActac,2011,1812(9):1089-1097.

8 Wang Z,Wang Z.Effects of rapamycin on expression of Bcl-2 and Bax in human lens epithelial cells and cell cycle in rats [J].JHuazhongUnivSciTechnologMedSci,2011,31(4):555-559.

9 Korkmaz D,Bastu E,Dural O,Yasa C,Yavuz E,Buyru F.Apoptosis through regulation of Bcl-2,Bax and Mcl-1 expressions in endometriotic cyst lesions and theendometrium of women with moderate to severe endometriosis [J].JObstetGynaecol,2013,33(7):725-728.

10 Ou Y,Yuan Z,Li K,Yang X.Phycocyanin may suppress D-galactose-induced human lens epithelial cell apoptosis through mitochondrialand unfolded protein response pathways [J].ToxicolLett，2012,215(1):25-30.

date：Oct 21,2013

Scientific Research Foundation of Hunan Provincial Science and Technology Department (No: 2014SK3021)From theDepartmentofOphthalmology,theSecondAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,Hengyang421001,HunanProvince,China

Inhibitive effects of Rosa laevigata on LEC apoptosis of diabetic cataract rats by increasing Bcl-2/Bax expression ratio

ZHOU Jun, HE Xiang-Zhen, XIAO Qi-Guo

Rosa laevigata; diabetic cataract; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

Objective To investigate the effects of Rosa laevigata on lens epithelial cell (LEC)apoptosis of diabetic cataract rats and its mechanism.Methods Sixty rats were random1y divided into normal control group, diabetic model group and treatment group, 20 cases in each group. The rats in control group were routine bred, the diabetic cataract models were induced by streptozotocin (STZ, 60 mg·kg-1)in model group. Rosa laevigata treatment group established in diabetic cataract at the same time, according to 400 mg·kg-1body weight given gastric perfusion of Rosa laevigata. At 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks after STZ injection, the changes of lens opacity were observed. TUNEL method was used to analyze the lens epithelial cells apoptosis, the expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical method, and the expression level of Bcl-2 and Bax mRNA were detected by RT-PCR.Results At 12 weeks, the body weight of model group, treatment group and control group were (151.90± 2.38)g, (412.99±2.17)g and (464.01±2.47)g, respectively, the model group was significantly lower than the treatment group and the control group (allP<0.05). At 4 weeks, the blood glucose in treatment group, control group and model group were (9.11±2.32)mmol·L-1, (3.83±0.79)mmol·L-1and (20.31±3.23)mmol·L-1, respectively, the differences between control group, treatment group and model group were statistically significant (allP<0.05). At 12 weeks, the blood glucose in treatment group, control group and model group were (5.62±1.25)mmol·L-1, (4.12±1.09)mmol·L-1and (25.02±2.27)mmol·L-1, respectively, the control group and treatment group were all lower than the model group (allP<0.05). At 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, the rats lens opacity degree in treatment group were all higher than those in the control group, but lower than those in the model group (allP<0.05). The apoptotic rate of LEC at 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks in model group were (8.35±1.20)%，(13.05±1.39)% and (23.69±1.88)%, respectively, the treatment group were (4.78±1.41)%, (6.08±0.95)% and (10.06± 1.66)%, respectively, and the control group were (1.18±0.16)%, (2.15±0.25)% and (3.53± 0.65)%, respectively, the differences were statistically significant between each group (allP<0.05). Compared with the control group, the protein and mRNA expression of Bcl-2 in the model group reduced, the protein and mRNA expression of Bax up-regulated, Bcl-2/Bax ratio decreased (allP<0.05). Compared with the model group, the protein and mRNA expression of Bcl-2 in LEC of the treatment group increased, the protein and mRNA expression of Bax decreased, the ratio of Bcl-2/Bax increased obviously (allP<0.05). Compared with the control group, the protein expression of Bcl-2 in LEC of the treatment group reduced, the protein expression of Bax increased (allP<0.05), but there was no statistical difference in Bcl-2 mRNA expression, Bax mRNA expression and Bcl-2/Bax mRNA ratio between two groups (allP>0.05).Conclusion Rosa laevigata can inhibit the LEC apoptosis of diabetic cataract rats by increasing Bcl-2/Bax expression ratio, and delay the occurrence and development of diabetic cataract.

周俊，男，1979年5月出生，硕士，主治医师。联系电话：0734-8288053；E-mail：nhf2zhoujun@163.com

AboutZHOUJun:Male,born in May,1979.Master degree.Tel:+86-734-8288053; E-mail：nhf2zhoujun@163.com

2013-10-21

湖南省科技厅科研基金资助(编号：2014SK3021)

421001 湖南省衡阳市，南华大学附属第二医院眼科

周俊,何湘珍,肖启国.金樱子通过增加Bcl-2/Bax表达比抑制大鼠糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡[J].眼科新进展,2014,34(4):314-318.

��

10.13389/j.cnki.rao.2014.0085

修回日期：2013-12-20

本文编辑：付中静

Accepteddate:Dec 20,2013

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):314-318]