Cox－2和HNF－3β在非小细胞肺癌中的表达及临床意义①

罗维贵，覃春艳，黄霞，邓俊华，覃雪梅，许建国

（右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000 E－mail：luoweiguiluo＠163.com）

肺癌是在临床上发病率最高的恶性肿瘤，尽管人们对其采用了积极和有效的防治措施，但其发病率及病死率依然呈现逐渐增多的趋势，为提高肺癌的早期诊断率和治疗有效率及降低病死率，寻找与肺癌发生、发展及预后的相关影响因素，特别是与肺癌相关的抑癌基因，成为其分子生物学研究的重点课题。肝细胞核因子 3β（hepatocyte nuclear factor，HNF－3βor Foxa2）作为肺癌的抑癌基因之一，近期受到广大学者的关注。而环氧化物酶－2（Cox－2）是一种诱导酶，其很少表达于正常组织，但人们发现，其参与了炎症或肿瘤的病理生理发展过程，特别是受到多种刺激因子刺激后显著表达，相关刺激因子主要包括：细胞因子、生长因子、促癌剂等。HNF－3β和Cox－2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的发生发展关系及相互作用，迄今未见相关文献报道。本研究旨在探讨 HNF－3β和Cox－2在NSCLC中表达及其临床意义，以期为肺癌的靶向治疗提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取2006年10月～2012年10月在我院心胸外科手术切除的60例经病理确诊为NSCLC组织标本为实验组，并以与其相应的距离癌组织5cm以上的50例正常肺组织标本为对照组，60例患者术前均未进行化疗、放疗或靶向治疗。在实验组中，男性为38例，女性为22例，年龄40～75岁，平均年龄为56.3岁；其中鳞癌20例，腺癌28例，腺鳞癌12例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期患者45例，Ⅲ期患者15例；有淋巴结转移26例，无淋巴结转移34例。60例NSCLC中，获随访者46例，随访率76.67% （46／60），随访时间5个月～5年，平均随访35.7个月。

1.2 方法 手术后所有新鲜标本均即时用10%多聚甲醛溶液固定，用石蜡包埋制作保存，组织蜡块进行4μm厚连续切片后固定于载玻片上。切片厚度4μm分别行HE染色和免疫组化染色。取已知阳性的切片做对照模板，用PBS代替做阴性对照模板。兔抗人Bcl－2单克隆抗体（SP21）和兔抗人HNF－3β单克隆抗体及相应试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供，操作步骤均严格按照说明书进行操作。

1.3 结果判定标准 将染色为棕黄色和棕褐色颗粒作为Cox－2和HNF－3β阳性信号标准。判定方法为于高倍显微镜下（10×40）随机选取10个不同视野，各计数100个癌细胞，免疫组化染色结果采用双盲方法测定。根据阳性细胞所占的百分率分为4级：＜5%为0分；5%～24%为1分；25%～50%为2分；＞50%为3分。显色度按细胞着色计分：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。取两者评分之和的数值作为结果判定，0分为（－），＜4分为（＋），＞4分为（＋＋）。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0软件包进行统计，Cox－2和 HNF－3β的表达、与临床病理参数的关系等计数资料，采用χ2检验，采用Spearman进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cox－2和 HNF－3β的表达 在NSCLC和癌旁正常组织中，Cox－2蛋白阳性（见图1）表达率分别为78.33%（47／60）和18.00%（9／50）；HNF－3β阳性（见图2）表达率分别为35.00% （21／60）和84.00%（42／50）。Cox－2在 NSCLC高表达，正常肺组织中低表达，而HNF－3β则与之相反，两者阳性表达率之间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 NSCLC及癌旁正常肺组织中Cox－2和HNF－3β蛋白表达 （n）

2.2 NSCLC组织中Cox－2和HNF－3β的表达与临床、病理特征的关系 Cox－2和HNF－3β的表达与性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型无关（P＞0.05）。Cox－2的阳性表达率与临床分期、淋巴结转移、病理分级呈显著相关性，差异有统计学意义（P＜0.05），但与分化程度无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）；HNF－3β阳性表达率与临床TNM分期、分化程度、病理分级、淋巴结转移之间比较，差异有统计学意义，呈明显负相关（P ＜0.05），见表2。

图1 Cox－2在肺癌组织中的表达

图2 HNF－3β蛋白在肺癌组织中的表达

表2 NSCLC中Cox－2和HNF－3β蛋白表达与临床病理特征的关系

表3 Cox－2和 HNF－3β蛋白在NSCLC中表达的相互关系

2.4 Cox－2和HNF－3β表达与NSCLC患者生存率的关系 在NSCLC患者中，获随访的46例其术后1、3和5年生存率分别为77.78%（14／18）、44.44%（8／18）和22.22%（4／18），而Cox－2表达弱阳性和阴性的28例患者其1、3和5年生存率分别为89.29%（25／28）、75.00%（21／28）和 53.57%（15／28），Cox－2强阳性者1、3、5年生存率显著下降（P ＜0.05）。46例获随访的NSCLC患者中，6例HNF－3β强阳性，其1、3和5年生存率均为98%，HNF－3β表达阴性的40例患者，其1、3和5 年 生 存 率 分 别 为 82.50% （33／40）、47.50% （19／40）和30.00%（12／40），呈显著下降（P ＜0.05）。

3 讨论

Cox－2是一种诱导型酶，其可以诱导花生四烯酸转化为前列腺素环内过氧化物（PGG2），并经一系列过程，最终将PGG2转化成为另一种产物PGH2。Cox－2在正常组织中很少表达，可在多种恶性肿瘤中高表达，并在多种因子刺激下开始产生，研究发现，Cox－2在肿瘤的细胞增殖、肿瘤血管形成及肿瘤的远处浸润及转移过程中起到了促进作用。Richardsen等［1］研究提示，在原发性前列腺癌组织中Cox－2呈明显高表达状态。Singh B等［2］研究表明Cox－2在乳腺癌的发生发展起到一定的促进作用。赵晓鸿等［3］通过免疫组化检测Cox－2、原癌基因c－fos编码产物（c－Fos蛋白）、原癌基因c－jun编码产物（c－Jun蛋白）以及活性T细胞核因子3（nuclear factor of activated Tcells3，NFAT3）在159例NSCLC中的表达情况，结果发现在NSCLC组织中Cox－2的表达与转录因子NFAT3和c－Fos的表达明显相关，这提示NFAT3和c－Fos可能对Cox－2的表达起到了共同调节的作用。Baratelli等［4］在NSCLC中的研究也发现，TGF－β在PGE2的促进下将纯化的CD4＋转化为调节T细胞表型，而PGE2在相应组织中的表达受到Cox－2的调控，这说明Cox－2在肿瘤的免疫介导中起抑制作用。Luo等［5］在84例NSCLC患者手术后标本中Cox－2的表达研究表明：在NSCLC中，Cox－2可上调VEGF和MVD在NSCLC的表达，同时还提示，加入PKC抑制剂后，可明显降低了A549、A431和H460中的VEGF的表达，而加入PKC激活剂后则能增强VEGF的表达，因此我们得出：在NSCLC中，Cox－2能够介导的VEGF的上调，而PKC路径在此过程中起到了非常重要的作用。其VEGF的表达均明显下调，说明可调控VEGF的表达，从而促进肿瘤血管的生成。本研究结果显示，Cox－2和HNF－3β的表达与性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型无关。在正常组织中仅2例Cox－2表达为（＋），阳性率为10%；60例NSCLC组织中43例表现为阳性，阳性率为71.67%。Cox－2的阳性表达率与临床分期、淋巴结的转移、病理分级呈显著相关性，且在Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、病理分级Ⅲ级病例中明显高表达于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、病理分级Ⅰ～Ⅱ级的病例，Cox－2的表达明显影响着患者术后生存期的长短，NSCLC患者中，其恶性程度越高，Cox－2的阳性表达则明显增强。Cox－2影响了NSCLC的发生、发展和预后，其机制可能是Cox－2促进肿瘤血管的形成，提供了肿瘤生长所需营养的途径，并参与了肿瘤的远处转移。

HNF－3β是HNF－3家族三个成员之一，它具有一个翼旋（wingedhelix）区，该区为一高度保守的DNA结合区，是以单体的形式结合［6］。相关体外的肿瘤细胞培养实验发现，在鳞癌、腺癌、NSCLC等大多数肿瘤细胞系中，其相关肿瘤细胞内HNF－3β呈现低表达状态，在加入HNF－3β后，肿瘤细胞明显增殖变慢、凋亡，这表明了HNF－3β是一种很强的肺癌抑制因子［7］。研究发现，在肿瘤发生、发展后期，TGF－β1可以促进细胞分化、转化及促血管内皮细胞生长，从而促进了肿瘤血管生成、肿瘤细胞浸润、转移和免疫抑制作用。使其与肺癌，尤其是NSCLC的发生、进展、淋巴结转移等有密切的关系，但其具体机制尚未完全明确［8］。提示HNF－3β能够抑制肺癌形成过程中的上皮—间充质转分化过程，阻碍了肺癌的形成、增殖、扩散的作用［9］。本研究提示，HNF－3β在正常肺组织及NSCLC中的阳性表达率分别为83.3%和36%，其阳性表达与TNM分期、组织病理类型、淋巴结转移相关，HNF－3β在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腺癌及有淋巴结转移的组织中，表达阳性率降低，提示HNF－3β在NSCLC侵袭、转移中起一定抑制作用。在随访的46例NSCLC患者中我们发现：HNF－3β表达低下的患者，其总体无瘤生存期比 HNF－3β高表达者相对缩短，这表明了HNF－3β的表达可能与NSCLC患者的临床预后存在一定的关系，能够作为一种有待于开发利用于肺癌分期及临床预后的标志物。

综上所述，在NSCLC中Cox－2与HNF－3β的表达呈现负相关性，其中Cox－2的高表达、HNF－3β的低表达，两者在NSCLC的发生、发展过程中起了重要作用，并且与预后明显相关，在基础研究和临床工作中检测Cox－2和HNF－3β对促进NSCLC患者的生物学行为研究和预测临床预后有重要意义。为进一步探讨NSCLC发病机制以及探寻NSCLC治疗新途径提供实验依据。

［1]Richardsen E，Uglehus RD，Due J，et al.Cox－2is overexpressed in primary prostate cancer with metastatic potential and may predict survival.A comparison study between Cox－2，TGF－β，IL－10and Ki67［J］.Cancer Epidemiology，2010，34（3）：316－322.

［2]Singh B，Cook KV，Vincent L，et al.Role of Cox－2in tumorospheres derived from a breast cancer cell line［J］.Journal of Surgical Research，2011，168（1）：e39－49.

［3]赵晓鸿，陈照丽，赵守华，等.Cox－2及其转录因子NFAT3和c－Fos在非小细胞癌中的表达及意义［J］.中国肺癌杂志，2010，13（11）：1035－1040.

［4]Baratelli F，Lee JM，Hazra S，et al.PGE2contributes to TGF－βinduced T regulatory cell function in human non－small cell lung cancer［J］.Am Transl Res，2010，2（4）：356－367.

［5]Luo Honghe，Chen Zhenguang，Jin Hui，et al.Cyclooxygenase－2up－regulates vascular endothelial growth factor via a protein kinase C pathway in non－small cell lung cancer［J］.Clinical Cancer Research，2011，30（1）：6.

［6]Lee CS，Sund NJ，Behr R，et al.Foxa2is required for the differentiation of pancreatic alpha－cells［J］.Dev Biol，2005，278（2）：484－495.

［7]Qi J，Nakayama K，Cardiff RD，et al.Siah2－dependent concerted activity of HIF and FoxA2regulates formation of neuroendocrine phenotype and neuroendocrine prostate tumors［J］.Cancer Cell，2010，18（1）：23－38.

［8]Xu CC，Wu LM，Sun W，et al.Effects of TGF－βsignaling blockade on human A549lung adenocarcinoma cell lines［J］.Mol Med Report，2011，4（5）：1007－1015.

［9]Tang Y，Shu G，Yuan X，et al.FOXA2functions as a suppressor of tumor metastasis by inhibition of epithelial－to－mesenchymal transition in human lung cancers［J］.Cell Res，2011，21（2）：316－326.