波长切换高效液相色谱法同时测定化胃舒颗粒中4 种有效成分的含量＊

2014-07-24尤献民邹桂欣邸子真

中国药业 2014年4期

尤献民，邹桂欣，邸子真

(辽宁省中医研究院，辽宁沈阳 110034)

化胃舒颗粒由黄芪、人参、法半夏、当归、陈皮、甘草等13 味中药组方，具有益气养阴、和胃降逆之功效，临床用于治疗癌症患者使用化学治疗药物损伤脾胃造成的食欲不振、腹胀、恶心、呕吐等症。方中黄芪具有抗肿瘤、增强机体免疫力的作用，甘草具有抗炎、抗溃疡的作用，当归具有补血活血、提高机体免疫力的作用，陈皮具有促进消化、解痉等作用，均为处方中主要药效组分。曾有文献报道了化胃舒颗粒中黄芪甲苷和人参总皂苷的含量测定[1-3]，但多组分同时测定还未见报道。笔者建立了反相高效液相色谱波长切换法，测定化胃舒颗粒中毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷4 种成分的含量，该方法简便、准确、灵敏度高，为该药质量标准的制订提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent1100 型高效液相色谱仪;DAD 二级管阵列检测器(美国);8453A 型紫外分光光度计(日本岛津);KQ-250DB 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);FA1004 型万分之一电子分析天平(上海上天精密仪器有限公司);SHB Ⅲ型循环水式真空泵(郑州长城公贸有限公司)。化胃舒颗粒(辽宁富东制药有限公司，规格为每袋10 g，批号为11112401，11112402，11112403)，毛蕊异黄酮苷对照品(批号为111920-201203)、甘草苷对照品(批号为111610-201001)、阿魏酸对照品(批号为110773 -201012)、橙皮苷对照品(批号为110721-200613)均由中国药品生物制品检定所提供;乙腈(色谱纯，Dikma technologles inc.lot，批号为70151)，磷酸(色谱纯，Tedia compant，inc.lot，批号为807230)，乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号为20130206)，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Synergi C18柱(25 mm×4.6 mm，4 μm);流动相:体积分数为0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0 ～25 min时体积分数为17%的B，25 ～40 min 时体积分数为17%→20%的B，40 ～50 min 时体积分数为20%的B，50 ～60 min 时体积分数为50%→80%的B;流速:1 mL /min;检测波长:0 ～19 min、260 nm，19 ～22 min、237 nm，22 ～25 min、316 nm，25 ～40 min、280 nm;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。

2.2 溶液制备

精密称取4 种对照品适量，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各对照品贮备液。精密量取毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷对照品溶液适量，置同一25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为17.51，17.09，16.32，24.72 μg/L 的对照品混合溶液。取化胃舒颗粒50 g，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的乙醇50 mL，称定质量，回流提取30 min，放冷，称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，备用，即得供试品溶液。按处方比例称取化胃舒颗粒中缺黄芪、缺甘草、缺当归和缺陈皮药材及缺4 味药材的其他药材，按供试品溶液制备方法制备各阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

检测波长确定:分别吸取4 种对照品溶液各适量，在紫外分光度计200 ～400 nm 波长范围内扫描，结果毛蕊异黄酮苷在260 nm 附近有最大吸收，甘草苷在237 nm 附近有最大吸收，阿魏酸在316 nm 附近有最大吸收，橙皮苷在280 nm 附近有最大吸收。如果采用单一波长测定，不能使每个组分都在最适宜的检测波长下测定。采用高效液相色谱程序切换波长技术，可根据各组分的出峰顺序，在不同时间段分别用其相应组分的最大吸收波长(检测波长:0 ～19 min，260 nm;19 ～22 min，237 nm;22 ～25 min，316 nm;25 ～40 min，280 nm)进行检测，可大大提高各成分检测灵敏度，使测定结果更加准确。

专属性考察:在拟订色谱条件下，毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，对称因子均在0.95 ～1.05，理论板数分别不低于5 000，3 000，4 000，4 000。阴性对照品溶液对毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷的测定无干扰，方法专属性良好，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:依次精密吸取混合对照品溶液5，10，15，20，25 μL，在拟订色谱条件下进样，记录色谱图。以对照品进样量(X，μg)为横坐标、对照品峰面积A 为纵坐标进行线性回归，得回归方程毛蕊异黄酮苷为A =3 119.4 C -10.1(r =1，n =5)，甘草苷为A =970.16 C -9.3(r =0.999 8，n =5)，阿魏酸为A =1 861.5 C-20.5(r=0.999 9，n=5)，橙皮苷为A=1 141.6 C-10.7 (r=0.999 8，n=5)。结果表明，进样量毛蕊异黄酮苷在0.087 5 ～0.437 8 μg 范围内、甘草苷在0.085 45 ～0.427 3 μg 范围内、阿魏酸在0.081 6 ～0.408 μg 范围内、橙皮苷在0.123 5 ～0.618 μg 内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取混合对照品溶液，在拟订色谱条件下连续进样6 次，每次20 μL。结果毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷的峰面积RSD 分别为1.5%，1.1%，1.2%和1.0%，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取样品2 g，依法制备供试品溶液，平行6 份，按拟订色谱条件进样分析。结果毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷含量的RSD 分别为1.1%，1.2%，1.5%，1.3%，表明方法重现性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于室温放置2，4，8，12，24 h 时，在拟订色谱条件下进样分析。结果毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷色谱峰面积的 RSD 分别为1.3% ，1.2%，1.6%，1.4%，表明供试溶液室温下放置24 h 各待测组分稳定。

加样回收试验:称取已知含量的供试品，平行9 份，每份1 g，精密称定，分别加入低、中、高3 个质量浓度的混合对照品溶液，依法制备供试品溶液，拟订色谱条件进样分析。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3 批化胃舒颗粒，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，采用外标点法计算毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷含量。结果见表2。

3 讨论

供试品溶液制备时，曾分别采用50%乙醇及70%乙醇进行超声和回流提取，结果用50%乙醇与70%乙醇提取，4 种有效成分含量相差无几，但用50%乙醇提取时色谱峰峰形好于70%乙醇，因此确定用50%乙醇。在进行超声提取与回流提取的试验中发现，回流提取时橙皮苷的含量高于超声提取，其他3 种成分无明显差异，因此确定采用回流提取法制备供试品溶液。

参照文献报道，以多种流动相系统对4 组分进行分离，结果表明在甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸系统中，甘草苷与阿魏酸色谱峰保留时间接近，分离度小于1.5，改用乙腈-水及乙腈-磷酸水梯度洗脱系统试验，发现水相中加入少量的磷酸可使色谱峰及分离度得到改善，但随着磷酸含量增加，基线向上漂移，最终确定水相采用0.05%磷酸水溶液，可使4 组分有较好地分离;研究中曾采用不同填料的色谱柱，如Synergi C18柱、Zobax-DB C18柱及Hpersil C18柱进行分析，均得到了良好结果，提示本方法有良好的适用性。

本研究采用波长切换技术[4]，成功建立了同时测定化胃舒颗粒中蕊异黄酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷含量的反相高效液相色谱法，该方法简便、准确、灵敏度高，可为该药质量标准的制订提供依据。