微生物燃料电池中产电微生物的系统发育分析及筛选

费讲驰，滕 瑶，熊利芝，吴玉先，何则强

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000)

全世界每年约有4 200多亿m3的污水排入江河湖海，污染了5.5万亿m3的淡水，这相当于全球径流总量的14%以上。世界卫生组织统计，世界上许多国家正面临水资源危机，每年有300万～400万人死于和水污染有关的疾病。因此，污水处理及资源化、淡水的可持续利用等是亟需解决的问题［1］。然而，现有的能源利用方式存在如下缺点:效率不高，不可再生，环境污染严重等。开发一种持久高效的清洁能源或实现废物的资源化利用是缓解当前能源危机和解决环境问题的有效途径［2］。正在兴起的微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell，MFC)的研发为可再生能源生产和水污染处理提供了一条新途径。微生物燃料电池是近年来迅速发展起来的一种融合了污水处理和生物产电的新技术，能够在处理污水的同时收获电能［3］。MFC的研究始于20世纪80年代，然而，近几年来，随着直接将电子传递给固体电子受体的纯培养菌种的发现［4-5］，科学家发明了无需使用电子传递中间体的微生物电池，其中所使用的菌种可以将电子直接传递给电极而产生持续高效稳定的电流。在MFC这个系统中，产电微生物［6］是核心要素。因为微生物产电不是与其生存直接相关的自然选择压力，只是厌氧呼吸过程的延伸。所以微生物的产电效率在自然条件下是很低的。因此对现有的产电微生物进行驯化改良是进一步提高产电效率的重要一步。本文主要通过污水处理厂采集的污泥中驯化产电微生物，并探讨高效产电微生物群落的结构以及产电微生物特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 污泥 取自湖南省吉首市大田湾污水处理厂的曝气池，待其静置后取上清液。

1.1.2 培养基 ①富集培养基:本实验采用的富集培养基为1 g/L葡萄糖营养液，参照Logan实验室的配置方法［8］进行配置:葡萄糖1 g，50 mmol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)100 mL，矿物质溶液12.5 mL，维他命溶液5 mL和污泥上清液500 mL;②筛选培养基:用于分离产电微生物的液体培养基为营养琼脂NA(Nutrient Agar)，配方:蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH值7.3;固体培养基为NA，其配方:蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，pH值7.3。

1.1.3 试剂与仪器 玻碳电极(GC130，天津艾达恒晟)，铂电极(Pt005，天津艾达恒晟)，Ag/AgCl电极(R0302，天津艾达恒晟)，电解池(C001，天津艾达恒晟)，电化学工作站(CHI660B，上海辰华)，万用表(UT800，优利德)，PCR仪(PE29600型，BIO-RAD公司)，PCR引物是由上海生工生物工程有限公司合成，其他常用试剂及仪器均购自邵阳科仪。

1.2 方法

1.2.1 MFC反应装置的构建 本实验中使用的是最普遍的“H”型双室微生物燃料电池［7］。如图1所示，该装置采用有机玻璃制成，主要由阳极室、阴极室、质子膜组件、硅胶垫圈、紧固螺栓和底座构成，装置阴阳两极室体积均为125 mL，阴阳电极材料均为碳布，有效面积为25 cm2。阴阳极室之间以质子交换膜(Nafion 117，Dupont)隔开，质子交换膜的有效面积为16 cm2。在阳极室和阴极室的圆筒上部分别设有带密封塞的取样孔、曝气孔，并配备电流电压、温度等在线监测控制装置、曝气装置。实验在(30±0.2)℃下进行。

图1 实验装置模式图Fig.1 Schematic diagram of experimental facility

1.2.2 产电微生物的富集 MFC反应器组装后，把配好的富集培养基注入到反应器中，将反应器和外电阻、万用表连接好，然后将其放入恒温水浴锅中，温度设定为30℃，利用数据采集系统实现实时的在线数据监测和记录。MFC反应器以间歇方式运行，接种过程中通过定期更换接种液来完成，每次先是将MFC内的部分原接种液取出，然后加入新鲜的接种液，待反应器每个周期都能产生稳定的输出电压即可认为启动成功。微生物燃料电池启动实际上是微生物在电极表面形成生物膜的过程，也是转移电子的微生物和其他种群微生物的竞争过程，电压的升高是电极对转移电子微生物选择的结果。启动成功后进入正式运行期，当监测的输出电压低于50 mV时开始换水，并记为一个周期，此时不再需要添加菌种，其他进水成分和启动期一样。

1.2.3 产电微生物的筛选 在无菌操作台上用灭菌的刀片刮下附着在阳极碳布电极上的生物膜，接种到装有灭菌NA液体培养基的无菌玻璃管中，放入厌氧培养箱于30℃条件下培养1 d。按10倍的浓度梯度稀释至10－7倍，均匀涂布在NA固体培养基上，放入厌氧培养箱于30℃条件下培养2～3 d。拿出固体培养基，在无菌操作台上，根据平板上形成的菌落形态、颜色、透明性等特征，用灭菌后的竹签挑取表面特征差异明显的菌种，分别接种至NA液体培养基中进行厌氧培养。如此反复传代7～8次，得到一批纯化的菌种，将得到的各株纯菌冷冻保存。

1.2.4 基于菌株16S rRNA基因序列的系统发育测定及多样性分析 对具有抗菌活性细菌进行基因组DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增，PCR产物纯化和序列测定按Cui等［9］使用的方法进行。得到测序结果提交到GenBank注册，获得序列号，从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中调出相似性较高的菌株的16S rRNA基因序列。使用CLUSTAL.X 1.8软件进行基因序列多重比对，用MEGA 4.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析，构建系统发育树［10］。同时重复取样1 000次进行自展值(Bootstrap)分析，评估系统发育树的拓扑结构的稳定性［11］。

1.2.5 产电微生物的电化学活性测试 将菌株在已灭菌的液体NA培养基中厌氧培养48 h后，取20 mL菌悬液，经离心和清洗后重悬于含50 mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液中，利用电化学工作站，用玻碳电极、铂丝电极和Ag/AgCl参比电极以3点极模式，在高纯N2保护下，以0.002 V/s的缓冲放电频率在－1.0～0 V之间循环测试菌悬液的氧化还原特性，绘制循环伏安曲线。

2 结果与分析

2.1 产电微生物富集

图2 产电微生物富集过程Fig.2 Process of Electrigens enriched

从图2可以看出产电微生物在MFC反应器中的富集过程:在连续富集了149 h的时候，产电微生物的电压达到了57.4 mV，说明此时阳极的碳布电极上已经有少量的产电微生物富集，并且在经过了多次的换取接种液之后，在长达201 h之内电量都在50 mV上下浮动，趋于稳定状态，表明MFC已经成功启动。此时不再需要添加菌种进行富集培养，而是在输出电压低于50 mV时开始换水。从图2可以看出，整个产电微生物富集的过程中，输出电压在47 981 min达到了最高值287.1 mV，并且已达到产电微生物筛选的要求。电压持续在150 mV时将MFC停止工作并拆解，在阳极碳布上取样。

2.2 产电微生物筛选

对产电微生物进行纯化筛选，经过连续7代的纯化，得到52株菌株，菌株形态如表1所示。

表1 菌株形态表Table1 Strain morphological table

续表

2.3 对菌株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析

对52株产电菌株进行基因组DNA的提取，然后进行16S rRNA基因的PCR扩增，成功获得了41株菌株的PCR产物，并进行产物纯化和序列测定，测出了38株菌株的序列。根据系统发育分析结果，采用16S rRNA基因序列相似性大于97%的菌株属于同一物种的归类原则［12］，38株菌可归为26个物种(表2和图3)。分离菌株与其相关的有效发表种典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在92.164%～99.618%，说明菌株与其系统发育关系最密切的相关菌株之间存在较大的遗传差异。

表2 产电微生物与其系统发育关系最密切的典型菌株间的系统发育关系Table2 The phylogenetic relationship between Electrigens and phylogenetic relationship closestly related type strains

图3 微生物产电菌潜在新类群的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Electrigens Potential new groups

16S rRNA基因序列相似性比较分析结果显示，38个菌株中有3株与其系统发育关系最密切的有效发表种典型菌株的16S rRNA基因序列存在较大差异(表2和图3中菌号加粗的菌株)，分别代表新的分类单元。其中菌株F050与其系统发育关系最密切的已知物种典型菌株(Sphingob-acterium multivorum)的序列相似性为93.956%，自展值达到了100%，而菌株F003与其系统发育关系最密切的已知物种典型菌株(Pseudomonas beteliATCC 19861T)的序列相似性达到96.286%，自展值为77%;F042与其系统发育关系最密切的已知物种典型菌株(Paludibacterium yongneupense5YN8-15T)的序列相似性为95.907%，自展值为84%。

2.4 产电微生物的电化学活性测试

用循环伏安法测纯菌悬液，峰可代表菌株电化学活性的强弱，对38株菌株的电化学活性测试，发现以下4株菌的电化学活性较为显著，如图4所示，分别是7号菌、10号菌、17号菌和51号菌。其中，7号菌氧化峰高约0.4 μA，还原峰高约0.4 μA;10号菌氧化峰高约0.5 μA，还原峰高约0.6 μA;17号菌氧化峰高约0.6 μA，还原峰高约0.5 μA;51号菌氧化峰高约0.4 μA，还原峰高约0.4 μA。表明10号菌和17号菌的电化学活性比7号菌和51号菌更为显著。

图4 4株菌的循环伏安曲线Fig.4 4 strains cycle volt-ampere curve

3 讨论

本文以污水处理厂的剩余污泥为反应物，对其中的产电微生物进行富集筛选，通过基于16S rRNA对菌株进行基因序列的系统发育多样性分析，把菌株进行物种归类，并找出可能代表新的分类单元的菌株F003、F042和F050。之后又对38株菌株进行电化学活性测试，只得到电化学活性较强的4株菌株，其他电化学活性表现较弱的很可能是一些发酵、产酸微生物，主要对水中有机物进行初步降解，为产电微生物产电提供合适的基质，对产电具有直接或间接的辅助功能，本文为后续研究纯产电菌株奠定了基础。

［1］吴祖林，刘静.生物质燃料电池的研究进展［J］.电源技术，2005，29(5):333-340.

［2］王舜，张颖.关于能源与环境关系的历史考察与对策研究［J］.对策研究，2007，(8):68-69，127.

［3］Allen RM，Bennetto HP.Microbial fuel cells-Electricity production from carbohydrates［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1993，39(40):27-40.

［4］Kim HJ，Prak HS，Hyun M.S，et al.A mediatorless microbialfuel cell using a metal reducing bacterium，Shewanella putrefacians［J］.Enzyme Microbiol.Technol.，2002，30:145-152.

［5］Park DH，Zeikus J.G.Impact of electrode composition on electricity generation in a single-compartment fuel cell using Shewanella.Putrefaciens［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2002，59:58-61.

［6］Lovley DR.Microbial fuel cells:novel microbial physiologies and engineering approaches［J］.Current Opinion in Biotechnology，2006，17(3):327-32.

［7］Logan BE.，Hamelers B，Rozendal RA，et al.Microbial fuel cells:Methodology and technology［J］.Environmental Science＆ Technology，2006，40(17):5181-5192.

［8］Logan BE.How to Innoculate your Cube MFC［EB/OL］.http://www.engr.psu.edu/ce/enve/logan/bioenergy/mfc_make_cell.htm，April 10th，2011.

［9］Cui XL，Mao PH，Zeng M，et al.Streptimonospora salina gen.nov.，sp.nov.，a new member of the family Nocardiopsaceae［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2001，51(2):357-363.

［10］Saitou N，Nei M.The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees［J］.Molecular Biology and Evolution，1987，4(4):406-425.

［11］Felsenstein J.Confidence limits on phylogenies:an approach using the bootstrap［J］.Evolution，1985，39(4):783-791.

［12］Stackebarandt E，Gebel BM.Taxonomic note:a place for DNADNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definitionin in bacteriology［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1994，4(4):846-849.