实验室常用菌种的保存和管理

任小龑

摘 要：保藏菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被杂菌污染。因此，选择有效且稳定的保藏微生物菌种的方法至关重要。

关键词：菌种；保存；管理

医学病原生物学实验室主要承担微生物实验教学任务，日常工作中经常要分离、鉴定细菌、试教演示、保存菌种等。菌种是微生物实验的基本材料，因涉及到师生的安全，所以要正确保存，妥善管理，逐步实现菌种的保存制度化与科学化。

一、材料与方法

1.教学实验常用的菌种保存

营养要求不高的菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌。

营养要求高的菌种：链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、脑膜炎奈瑟菌。

厌氧芽孢杆菌：产气荚膜杆菌。

需氧芽胞杆菌：枯草芽孢杆菌。

真菌：白色念珠菌、新生隐球菌。

2.菌种的鉴定

实验室中保存的菌种都要经过鉴定合格后方可使用，常用的鉴定方法有形态学观察、菌落特征、生化反应及血清学鉴定。

3.菌种的保存

（1）定期传代保存法

传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低，培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。①液体培养基低温保存法。将保持营养要求不高的细菌接种于装有营养肉汤的试管中，营养要求高的细菌接种于含15%血清的营养肉汤中，经37℃培养18~14小时后，取出封口，置4℃冰箱保存。②半固体穿刺保存法。将细菌穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18~24小时后，在无菌条件下加入灭菌液体石蜡，厚度约1厘米，封口后置4℃冰箱保存。③琼脂斜面保存法。营养要求不高的菌种用普通琼脂斜面保存法，营养要求高的菌种用血液琼脂斜面保存，将细菌蜿蜒接种于血液琼脂斜面上，置37℃培养18~24h后，石腊封口，放于4℃冰箱保存。④沙保氏培养基保存法。该培养基用于保存真菌，将白色念珠菌、新型隐球菌接种于沙保氏半固体培养基上，经37℃培养1~3天后，加入灭菌的液体石蜡，置4℃冰箱保存。

传代培养保存法操作简单、使用方便，不需要特殊设备，是实验室菌种保存最常用的方法。但其缺点也很明显，如：保存时间短，菌种管棉塞经常容易发霉；菌株的遗传性状容易发生变异；反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期转种，工作量大；杂菌的污染机会较多。

（2）液体石蜡覆盖保存法

该法较前一种方法保存菌种的时间更长，将液体石蜡灭菌，放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，要求液体石蜡高出菌斜面1cm左右，若不够此高度，则常会引起斜面抽干现象，将试管直立，贴上标签，置4℃下保存，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。

（3）冷冻真空干燥保存法

将待存菌分纯后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，把菌悬液滴入菌种管后，在管口抽取少许棉花塞入管内细颈处，放入冰箱－40℃速冻40分钟，放入准备好的混有盐的冰中，接上真空泵，真空抽干呈粉末状，火焰封口，贴上标签，保存于冰箱。此法保存时间长，可达15年，不易变性，但需要专用仪器，一般实验室难以配备，而且过程复杂，操作难度大，需要较长时间才能完成。所以此方法适合具有条件的实验室菌种的长期保存。

4.菌种的保管——安全管理制度

（1）专人负责

存放菌种的冰箱加锁，保管人员定期培训，具备较强的责任心，严格执行《病原微生物实验室生物安全管理条例》。

（2）详细记录

每一种菌种都贴标签，包括名称、编号、来源、接种日期、鉴定者、保存要求及使用情况。

（3）定期传代接种

按规定检查、鉴定，并接种保证菌种纯度质量。

二、结果

液体培养基低温可保存菌种1年至数年；半固体穿刺可保存3个月，琼脂斜面可保存一个月；吕氏血清斜面可保存半个月至一个月；沙包氏培养基可保存3~6个月；冷冻真空干燥可保存3~5年。链球菌在普通培养基生长不良，可接种于血液琼脂斜面上，每隔半个月要重新接种培养；沙包氏培养基保存真菌效果好、时间长。实验室里保存的菌种不少对人体具有致病性，多次传代接种易被污染和发生变异，因此工作人员操作时要规范并做好安全防护工作，用过的接种环要立即灭菌，涂片镜检后立即消毒，用过的器皿应放入指定容器，经高压灭菌处理。

三、讨论

保存菌种的原则是根据微生物的生理、生化特性，尽量降低微生物的代谢水平，使其基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制，但又不至于死亡，以降低菌种的变易率。我们在做实验过程中或者短期保存菌种时，可以选择斜面低温保存法、半固体琼脂法、液体石蜡保存法、半固体琼脂石蜡保存法进行保存；如果需要较长时间的保存菌株，可以选择冷冻真空干燥法保存菌株，此法需要实验室配备好相应的仪器设备。如果一些菌株营养要求比较高的话，当然上述菌株保存的方法不是最理想、最方便的保存法，还需要我们不断探索，找到一种或几种简单、方便、时间长的最佳保存方法。

参考文献：

[1]魏保生.医学微生物学笔记[M].北京：科学出版社,2009.

[2]唐珊煕.微生物学及微生物学检验[M].北京:人民卫生出版社,2003.