大豆子叶节遗传转化受体体系的建立

曲静　刘思言　姚丹　淑艳　丕武　佳鑫

摘要：以3个大豆品种为试材，研究了种子消毒方法、丛生芽诱导和生根阶段不同的激素浓度对大豆子叶节再生的影响，以求建立一个高效的再生体系用于大豆的遗传转化。结果表明，大豆种子消毒的最佳方法为：70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，无菌水清洗3～5次。吉农28的最佳丛生芽诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；而对于吉农27和九农21，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA为最佳丛生芽培养基。在丛生芽诱导生根阶段，三种不同的基因型最佳的生根培养基均为1/2MS+2.0 mg/L IBA。

关键词：大豆；激素；丛生芽诱导；生根

中图分类号：S565.104.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0026-03

大豆（Glycine max L.）既是粮食作物，又是油料和饲料作物。自1988年Hinchee等[1]和McCabe等[2]获得转基因大豆植株以来，国内外学者开展了大量的大豆遗传转化研究工作，并取得一些突破性进展。以大豆无菌苗子叶节、茎尖、初生叶节、未成熟子叶、上胚轴和下胚轴等为外植体都获得了再生植株[2～9]。目前大豆的遗传转化多数以子叶节再生体系作为受体系统，但子叶节再生体系也存在诸如丛生芽少、不易伸长等缺点。因此迄今为止，大豆仍是公认的难转化的植物之一。

大豆子叶节稳定高效遗传转化受体体系的建立是提高大豆遗传转化效率的基础。本试验旨在筛选大豆种子消毒的最佳方法以及丛生芽诱导和生根的最佳培养基，完善目前大豆子叶节遗传转化受体体系，获得高效的再生体系，为转基因大豆的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为吉农28、九农21、吉农27三个大豆品种，均由吉林农业大学农学院副教授张君提供。

1.2试验方法

1.2.1种子消毒方法的研究选择健康饱满的大豆种子，自来水清洗干净，70%的酒精表面消毒30 s，采用三种不同的消毒方法对大豆种子进行消毒：①用6% NaClO进行消毒，消毒时间分别为12、15、18 min；②用0.1% HgCl2进行消毒，消毒时间分别为5、7、9 min；③用6% NaClO + 20% HCl进行消毒，消毒时间分别为120、240、360 min。然后用无菌水清洗3～5次，接种到MS培养基上，5 d后统计发芽率及污染率。

1.2.2丛生芽诱导培养基激素浓度筛选大豆种子萌发培养5～6 d后，取出萌发的种子，剥去种皮，保留2～3 mm下胚轴，将子叶从下胚轴处切开，除去顶芽及腋芽，置于不同的丛生芽诱导培养基上。芽诱导培养基分别为：①MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA；②MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；③MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA；④MS+2.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA。每个三角瓶约3～4个子叶节，于26℃、光照条件下培养，2周后对丛生芽诱导的情况进行统计分析。

1.2.3丛生芽生根培养基激素浓度筛选将分化出的丛生芽切下，以每瓶5个外植体接种于丛生芽生根培养基上，生根培养基以1/2MS为基本培养基，IBA浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，培养15 d，重复3次。培养条件与丛生芽诱导培养条件相同，每2天观察一次，记录生根的快慢、根形、生根率，筛选最佳浓度。

2结果与分析

2.1不同消毒方法消毒效果比较

以NaClO作为消毒剂时，种子发芽大多受到抑制，发芽率极低，可能是因为消毒剂渗透到浸泡之后的种子内部，对其造成了严重伤害。HgCl2和NaClO+HCl处理的种子萌发速度一致，2 d之后开始萌发，发芽率也一致，从试验操作的简便性方面考虑应选择HgCl2。在消毒时间方面可以看出7 min为最佳消毒时间，污染率为零（表1）。因此，HgCl2消毒7 min为最佳消毒方法。

2.2不同激素配比对丛生芽诱导的影响

接种约1周后，可见子叶节处有小芽长出，2周后对丛生芽诱导情况进行统计，结果见表2。可以看出，吉农28在激素浓度为1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA时的诱导率最高，达到89%；九农21在激素浓度为2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA时的诱导率最高，达到91%；吉农27在激素浓度为2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA时的诱导率最高，达到94%。

2.3不同IBA浓度对丛生芽生根的影响

大豆丛生芽诱导生根常采用的植物生长调节剂为IBA，这已被大多数研究者认同，本试验结果（表3）显示，三种基因型的大豆生根的最佳培养基均为1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

3结论与讨论

种子的消毒处理是建立大豆子叶节高效再生体系的前提和基础，消毒彻底的同时又要尽可能减少对种子的伤害。消毒时间长，可降低污染率，但对种子伤害较大，进而影响了种子的萌发。本试验结果显示，用0.1% HgCl2消毒种子7、9 min的污染率均为零，发芽率比消毒5 min低，这与曲桂芹教授研究的影响大豆体细胞胚诱导因素的结果一致[10]。

本试验研究结果表明，大豆种子消毒的最佳方法为70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，再用无菌水清洗3～5次。不同品种对丛生芽诱导培养基的要求存在差异，吉农28的最佳丛生芽诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA；而吉农27、九农21的最佳培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA + 0.8 mg/L IBA。在丛生芽诱导生根阶段，吉农28、吉农27、九农21的最佳生根培养基均为1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

外植体褐变是组织培养过程中常见的现象，为避免因外植体褐变造成培养材料的损失，本试验在子叶节外植体接种后，将外植体每隔7 d向新鲜培养基中转移一次，以减轻褐变造成的影响。同时在培养基中添加适量VC来减少褐变发生，效果比较理想。

参考文献：

[1]Hinchee M A W， Connor-Ward D V，Newell C A， et al.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium—mediated DNA transer[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：915-922.

[2]McCabe D E， Swain W F， Martinell B J， et al.Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：923-926.

[3]Cheng T Y， Saka H， Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant ScienceLetters， 1980， 19（2）： 91-99.

[4]Kartha K K， Pahl K， Leung N L， et al. Plant regeneration from meristems of grain legumes： soybean， cowpean， peanut， chickpea and bean[J]. Can J. Bot. 1981，59（9）：1671-1679.

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[7]Wright M S， Williams M H， Pierson P E， et al.Initiation and propagation of Giycine max L. Merr.：Plants：from tissue-cultured epicotyls[J].Plant Cell Cult.，1987， 8（1）：83-90.

[8]Dan Y， Reighceri N A. Organogenic regeneration of soybean from hypocotyl explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 1998， 34（1）： 14-21.

[9]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science， 2002， 52（1）： 1-8.

[10]曲桂芹，张贤泽，霍俊伟. 影响大豆体细胞胚诱导因素的研究[J].植物研究，2001，21（2）：210-215.

外植体褐变是组织培养过程中常见的现象，为避免因外植体褐变造成培养材料的损失，本试验在子叶节外植体接种后，将外植体每隔7 d向新鲜培养基中转移一次，以减轻褐变造成的影响。同时在培养基中添加适量VC来减少褐变发生，效果比较理想。

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外植体褐变是组织培养过程中常见的现象，为避免因外植体褐变造成培养材料的损失，本试验在子叶节外植体接种后，将外植体每隔7 d向新鲜培养基中转移一次，以减轻褐变造成的影响。同时在培养基中添加适量VC来减少褐变发生，效果比较理想。

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