蓖麻毒蛋白在蓖麻组培苗不同部位叶片中含量的测定

罗蕊+赵志强+黄凤兰等

摘要：本研究优化了从蓖麻叶片中提取蛋白的过程，利用硫酸盐沉淀法、BCA试剂盒、UVwin5紫外软件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析软件相结合的方法对蓖麻组培苗不同部位叶片中的毒蛋白的含量进行测定，结果表明，蓖麻叶片中毒蛋白的含量与叶位呈正比。

关键词：蓖麻；蓖麻毒蛋白；含量；叶位；硫酸盐沉淀法

中图分类号： S565.601文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0043-03

收稿日期：2013-05-30

基金项目：国家自然科学基金（编号：30760123、31060194）；国家民族事务委员会项目（编号：10NM02）；内蒙古自然科学基金（编号：2010BS0511）；内蒙古人才基金。

作者简介：罗蕊（1988—），女，内蒙古扎兰屯人，硕士研究生，主要从事植物基因工程研究。E-mail：luorui19880629@163.com。

通信作者：陈永胜，博士，教授，主要从事植物基因工程研究工作。E-mail：chenys-2012@hotmail.com。蓖麻（Ricinus communis L.），大戟科，世界十大油料作物之一[1]，具有很高的应用价值[2-5]。蓖麻中有毒的物质主要包括蓖麻碱、蓖麻毒蛋白、变应原、血球凝集素这4种物质，都具有很大的毒性。蓖麻毒蛋白是一种蛋白分解酶，是由毒类素、全毒素、凝集素这3种物质组成的蛋白质[6]，其相对分子量为64 000左右，也有报道为36 000～85 000。蓖麻毒素（ricin）为白色粉末状或结晶状，无味，不溶于有机溶剂，在饱和的硫酸铵溶液中能沉淀析出。蓖麻毒蛋白由A、B 2条链组成。A链是效应链，是一种具有N-糖苷酶活性的多肽；B链有凝集素的活性，能与细胞上的半乳糖的糖蛋白结合[7]。蓖麻提取物具有杀虫的特性，适用于开发生物农药。曾有人对蓖麻不同部位蓖麻碱的含量进行测定[8]，但至今国内还没有人测定过蓖麻不同时期叶片中毒蛋白的含量。本试验采用硫酸铵沉淀法、BCA蛋白试剂盒法、UVwin5紫外软件v5.1.0、BandScan蛋白定量分析软件相结合的方法，对蓖麻毒蛋白在蓖麻不同部位叶片中含量进行简单、快速、精确的分析测定，为研究蓖麻毒蛋白在植株各部位的含量分析奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

植物材料为通蓖5号蓖麻组织培养苗，由内蒙古民族大学蓖麻工程研究中心提供。

1.2仪器与试剂

Hema冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；紫外可见分光光度计-T6新世纪（北京普析通用仪器有限责任公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；BandScan蛋白定量分析软件。

1.3试验方法

1.3.1 蓖麻粗蛋白的提取参照曾佑炜等的方法[9]，对每1 g叶片中磷酸缓冲液的加入量和PEG的分子质量进行优化，同时对比冷藏叶片和新鲜叶片的提取效果，从而确定试验方法。取3株蓖麻组织培养苗，称取约1 g蓖麻不同部位的叶片，在液氮中充分研磨；按照1 g叶片加入10 mL 5mmol/L磷酸缓冲液（PBS，pH值6.5，含100 mmol/L NaCl，称为缓冲液A）的比例加入，并充分混匀；4 ℃放置过夜；4 ℃下17 000 r/min离心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪；重复离心1次，取上清；在上清中加入固体（NH4）2SO4，达到60%饱和度；4 ℃放置 3 h；4 ℃下17 000 r/min离心30 min；倒去上清，把沉淀溶解在缓冲液A中；装入透析袋（截留分子量：8 000～14 000），用PEG（分子量20 000）包埋后4 ℃透析3 h；4 ℃下 17 000 r/min 离心30 min，取上清即为毒蛋白粗品，记录所得的粗蛋白的体积，并设置3个重复。

1.3.2蓖麻粗蛋白含量的测定

1.3.2.1蛋白质标准曲线的制作标准曲线制作的操作步骤参照北京庄盟国际生物基因科技有限公司BCA蛋白定量试剂盒说明，得到浓度计算公式：C=k1×D562 nm+k0，其中：k0=-0.080 91，k1=0.982 79，D562 nm为波长为562 nm处吸光度，相关性为0.999 7。

1.3.2.2粗蛋白浓度测定取一定量粗蛋白，稀释100倍后测D562 nm，并根据蛋白标准曲线公式计算稀释100倍后粗蛋白的浓度μg/μL）。粗蛋白浓度C（μg/μL）=（k1×稀释100倍后的D562 nm+k0）×100。

1.3.2.3粗蛋白含量的计算根据粗蛋白的浓度、粗蛋白的体积和每个样品中提取粗蛋白时叶片的重量，计算出每1 g叶片粗蛋白的含量。粗蛋白含量（mg）=稀释100倍后浓度（μg/μL）×粗蛋白体积（mL）。1 g叶片粗蛋白含量（mg/g）=叶片中粗蛋白含量（mg）/叶片重量（g）。

1.3.3蓖麻毒蛋白含量的测定

1.3.3.1粗蛋白的SDS-PAGE电泳用12%的胶进行SDS-PAGE电泳，每个点样孔上样量为30 μL。

1.3.3.2蛋白条带灰度比重分析具体操作步骤参见BandScan软件操作说明。得到每个品种中每种蛋白质占粗蛋白的灰度百分比。

1.3.3.3毒蛋白含量计算根据BandScan软件分析毒蛋白占粗蛋白灰度百分比和每1 g叶片中粗蛋白含量，计算每1 g叶子中毒蛋白的含量。每1 g叶子中毒蛋白的含量（mg/g）=每1 g叶片粗蛋白含量（mg/g）×毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比。

2结果与分析

2.1蛋白标准曲线的制作

利用BCA法绘制的蛋白质标准曲线见图1。从图1可以看出，所制作的蛋白质标准曲线质量较好。

2.2蓖麻粗蛋白含量的测定

对3株蓖麻粗蛋白含量的测定结果见表1。

从表1可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中粗蛋白含量从真叶8到真叶14依次为6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE电泳

3株蓖麻不同部位叶片粗蛋白电泳结果见图2。从图2可以看出，毒蛋白分子量为32.0 ku和34.0 ku的2条带相距非常近，在电泳图中2条带有重叠的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析软件对3个植株不同部位叶片粗蛋白SDS-PAGE电泳结果进行分析，得出各种蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每个叶片的条带数不同，所以毒蛋白在分析时不在一条直线上。另外毒蛋白的2条带分子量差异较小，电泳过程中有些出现2条带重叠现象，导致软件分析时，被认为是1条带，但不影响软件的最后分析结果。

对3株蓖麻的蛋白灰度分析见图3和表1。

由表1和图3可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶8到真叶14依次为23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶11到真叶19依次为2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶13到真叶18依次为2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量计算

对3株蓖麻中毒蛋白的含量计算结果见表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶8到真叶14依次为0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶11到真叶19依次为0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶13到真叶18依次为0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根据表1求出每个叶片中含有毒蛋白的平均含量，结果见表2。

由图4可以看出，不同部位蓖麻叶片中的毒蛋白的含量随着叶位的增大而增加。

3结论与讨论

从总体上看，蓖麻叶片中的毒蛋白的含量与叶位呈正比。

蓖麻提取物中的主要杀虫物物质为蓖麻毒蛋白和蓖麻碱，蓖麻毒蛋白主要具有触杀作用，蓖麻碱则主要具有触杀胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物农药具有很好的前景。在条件优化过程中发现，经冷冻的叶片中毒蛋白的含量低于新鲜叶片中毒蛋白的含量，叶片在冷冻过程中毒蛋白会降解；老叶片中毒蛋白的含量低于幼嫩的叶片中毒蛋白的含量，随着叶片中粗纤维的增加，蛋白质总量减少，同时毒蛋白的含量也减少。

蓖麻籽主要用于榨油，经高温处理后，蓖麻中的主要毒性物质只有变性原和蓖麻碱，饼粕可用于提取蓖麻碱。蓖麻的叶片主要用于秸秆还田，利用蓖麻叶片提取蓖麻毒蛋白有利于对蓖麻的充分利用，减少资源浪费，有助于开发新型生物农药，本研究为蓖麻毒蛋白在整株蓖麻叶片的分布奠定了基础，有利于农药开发的后续研究。

参考文献：

[1]张宝贤，谭德云，刘红光，等. 我国蓖麻产业发展及其能源化利用的探讨[J]. 农业科技通讯，2010（1）：22-23.

[2]潘国才，丁爱华.蓖麻的综合利用现状[J]. 农业科技与装备，2009（1）：1-2，5.

[3]苏雅拉图. 蓖麻抗生育研究进展[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2011，26（3）：316-319.

[4]张红菊，赵怀勇. 蓖麻对盐渍土的改良效果研究[J]. 中国水土保持，2010（7）：43-44，66.

[5]张智勇，陈永胜，倪娜，等. 蓖麻产品在农药中的应用及研究进展[J]. 内蒙古农业科技，2011（6）：74-76.

[6]赵青余，桂荣，那日苏.蓖麻饼脱毒的研究进展[J]. 饲料工业，2002，23（11）：35-39.

[7]孙媚华，陈迁，宋光泉，等. 蓖麻毒蛋白的研究与应用[J]. 广东化工，2009，36（9）：144-145，162.

[8]温燕梅，冯亚非，郑明珠.蓖麻不同部位杀虫活性成分蓖麻碱的提取及含量[J]. 农药，2008，47（8）：584-585，606.

[9]曾佑炜，宋光泉，彭永宏，等. 蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究[J]. 中国农学通报，2004，20（4）：23-25，32.

[10]赵建兴，张树怀，佘国珍，等. 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[J]. 内蒙古农业大学学报：自然科学版，2001，22（4）：78-80.

2.2蓖麻粗蛋白含量的测定

对3株蓖麻粗蛋白含量的测定结果见表1。

从表1可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中粗蛋白含量从真叶8到真叶14依次为6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE电泳

3株蓖麻不同部位叶片粗蛋白电泳结果见图2。从图2可以看出，毒蛋白分子量为32.0 ku和34.0 ku的2条带相距非常近，在电泳图中2条带有重叠的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析软件对3个植株不同部位叶片粗蛋白SDS-PAGE电泳结果进行分析，得出各种蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每个叶片的条带数不同，所以毒蛋白在分析时不在一条直线上。另外毒蛋白的2条带分子量差异较小，电泳过程中有些出现2条带重叠现象，导致软件分析时，被认为是1条带，但不影响软件的最后分析结果。

对3株蓖麻的蛋白灰度分析见图3和表1。

由表1和图3可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶8到真叶14依次为23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶11到真叶19依次为2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶13到真叶18依次为2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量计算

对3株蓖麻中毒蛋白的含量计算结果见表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶8到真叶14依次为0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶11到真叶19依次为0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶13到真叶18依次为0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根据表1求出每个叶片中含有毒蛋白的平均含量，结果见表2。

由图4可以看出，不同部位蓖麻叶片中的毒蛋白的含量随着叶位的增大而增加。

3结论与讨论

从总体上看，蓖麻叶片中的毒蛋白的含量与叶位呈正比。

蓖麻提取物中的主要杀虫物物质为蓖麻毒蛋白和蓖麻碱，蓖麻毒蛋白主要具有触杀作用，蓖麻碱则主要具有触杀胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物农药具有很好的前景。在条件优化过程中发现，经冷冻的叶片中毒蛋白的含量低于新鲜叶片中毒蛋白的含量，叶片在冷冻过程中毒蛋白会降解；老叶片中毒蛋白的含量低于幼嫩的叶片中毒蛋白的含量，随着叶片中粗纤维的增加，蛋白质总量减少，同时毒蛋白的含量也减少。

蓖麻籽主要用于榨油，经高温处理后，蓖麻中的主要毒性物质只有变性原和蓖麻碱，饼粕可用于提取蓖麻碱。蓖麻的叶片主要用于秸秆还田，利用蓖麻叶片提取蓖麻毒蛋白有利于对蓖麻的充分利用，减少资源浪费，有助于开发新型生物农药，本研究为蓖麻毒蛋白在整株蓖麻叶片的分布奠定了基础，有利于农药开发的后续研究。

参考文献：

[1]张宝贤，谭德云，刘红光，等. 我国蓖麻产业发展及其能源化利用的探讨[J]. 农业科技通讯，2010（1）：22-23.

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[8]温燕梅，冯亚非，郑明珠.蓖麻不同部位杀虫活性成分蓖麻碱的提取及含量[J]. 农药，2008，47（8）：584-585，606.

[9]曾佑炜，宋光泉，彭永宏，等. 蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究[J]. 中国农学通报，2004，20（4）：23-25，32.

[10]赵建兴，张树怀，佘国珍，等. 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[J]. 内蒙古农业大学学报：自然科学版，2001，22（4）：78-80.

2.2蓖麻粗蛋白含量的测定

对3株蓖麻粗蛋白含量的测定结果见表1。

从表1可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中粗蛋白含量从真叶8到真叶14依次为6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE电泳

3株蓖麻不同部位叶片粗蛋白电泳结果见图2。从图2可以看出，毒蛋白分子量为32.0 ku和34.0 ku的2条带相距非常近，在电泳图中2条带有重叠的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析软件对3个植株不同部位叶片粗蛋白SDS-PAGE电泳结果进行分析，得出各种蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每个叶片的条带数不同，所以毒蛋白在分析时不在一条直线上。另外毒蛋白的2条带分子量差异较小，电泳过程中有些出现2条带重叠现象，导致软件分析时，被认为是1条带，但不影响软件的最后分析结果。

对3株蓖麻的蛋白灰度分析见图3和表1。

由表1和图3可以看出：第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶8到真叶14依次为23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶11到真叶19依次为2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比从真叶13到真叶18依次为2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量计算

对3株蓖麻中毒蛋白的含量计算结果见表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶8到真叶14依次为0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶11到真叶19依次为0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位叶片中毒蛋白含量从真叶13到真叶18依次为0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根据表1求出每个叶片中含有毒蛋白的平均含量，结果见表2。

由图4可以看出，不同部位蓖麻叶片中的毒蛋白的含量随着叶位的增大而增加。

3结论与讨论

从总体上看，蓖麻叶片中的毒蛋白的含量与叶位呈正比。

蓖麻提取物中的主要杀虫物物质为蓖麻毒蛋白和蓖麻碱，蓖麻毒蛋白主要具有触杀作用，蓖麻碱则主要具有触杀胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物农药具有很好的前景。在条件优化过程中发现，经冷冻的叶片中毒蛋白的含量低于新鲜叶片中毒蛋白的含量，叶片在冷冻过程中毒蛋白会降解；老叶片中毒蛋白的含量低于幼嫩的叶片中毒蛋白的含量，随着叶片中粗纤维的增加，蛋白质总量减少，同时毒蛋白的含量也减少。

蓖麻籽主要用于榨油，经高温处理后，蓖麻中的主要毒性物质只有变性原和蓖麻碱，饼粕可用于提取蓖麻碱。蓖麻的叶片主要用于秸秆还田，利用蓖麻叶片提取蓖麻毒蛋白有利于对蓖麻的充分利用，减少资源浪费，有助于开发新型生物农药，本研究为蓖麻毒蛋白在整株蓖麻叶片的分布奠定了基础，有利于农药开发的后续研究。

参考文献：

[1]张宝贤，谭德云，刘红光，等. 我国蓖麻产业发展及其能源化利用的探讨[J]. 农业科技通讯，2010（1）：22-23.

[2]潘国才，丁爱华.蓖麻的综合利用现状[J]. 农业科技与装备，2009（1）：1-2，5.

[3]苏雅拉图. 蓖麻抗生育研究进展[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2011，26（3）：316-319.

[4]张红菊，赵怀勇. 蓖麻对盐渍土的改良效果研究[J]. 中国水土保持，2010（7）：43-44，66.

[5]张智勇，陈永胜，倪娜，等. 蓖麻产品在农药中的应用及研究进展[J]. 内蒙古农业科技，2011（6）：74-76.

[6]赵青余，桂荣，那日苏.蓖麻饼脱毒的研究进展[J]. 饲料工业，2002，23（11）：35-39.

[7]孙媚华，陈迁，宋光泉，等. 蓖麻毒蛋白的研究与应用[J]. 广东化工，2009，36（9）：144-145，162.

[8]温燕梅，冯亚非，郑明珠.蓖麻不同部位杀虫活性成分蓖麻碱的提取及含量[J]. 农药，2008，47（8）：584-585，606.

[9]曾佑炜，宋光泉，彭永宏，等. 蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究[J]. 中国农学通报，2004，20（4）：23-25，32.

[10]赵建兴，张树怀，佘国珍，等. 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[J]. 内蒙古农业大学学报：自然科学版，2001，22（4）：78-80.