栀子内生真菌的分离与鉴定

林贵兵+高娜+徐萍霞+刘勇+葛菲

摘要：分离纯化栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落多样性。结果表明，从栀子果实中分离获得了42株内生真菌，初步鉴定为1目1科9属，交链孢霉属（Alternaria spp.）1株，占2.38%；青霉属（Penicillium spp.）3株，占7.14%；曲霉属（Aspergillus spp.）3株，占714%；轮枝霉属（Verticillium spp.）3株，占7.14%；瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）2株，占4.76%；穗霉属（Spicaria spp.）2株，占476%；头孢霉属（Cephalosporium spp.）1株，占2.38%；粘帚霉属（Gliocladium spp.）1株，占2.38%；双曲孢霉属（Nakataea spp.）26株，占61.9%。其中双曲孢霉属为优势菌群。

关键词：栀子；内生真菌；分离；鉴定

中图分类号： S567.1+90.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0298-03

收稿日期：2013-07-18

基金项目：江西省教育厅科技计划（编号：GJJ12537）；江西中医药大学博士启动基金；江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。

作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，主要从事中药资源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果实，是一种常见的中药，也是江西省道地药材之一，具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效，外敷可治扭伤瘀肿，主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地，不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2～6]，栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法，以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长，增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性，部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成，产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落的多样性。

1材料与方法

1.1材料

2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实，经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候，气候湿润温和，日照充足，年均气温17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相对湿度为78.5%。

1.2方法

1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）与混合抗生素（80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解）培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净，再用无菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇处理5 min，对果实表面进行消毒，再用无菌水冲洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培养基中，28 ℃ 下恒温培养 7～10 d。待组织块周围长出白色菌丝后，用接种针挑起，纯化菌种。

1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中，采用插片法在28 ℃下恒温培养7～10 d，观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色，参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。

2结果与分析

2.1内生真菌种群

2.1.1交链孢霉属（Alternaria spp.）菌落生长迅速，初期为黑色，随后有灰白色棉絮状菌生长，背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色，通常较短，单生或分枝简单，直或略弯曲，有隔。分生孢子暗色，横隔1～6个，纵隔0～5个，倒棍棒形、椭圆形或卵形，顶端常延长为喙状，经常向顶着生成链（图1）。

2.1.2青霉属（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，绒毛状、蛛网状或棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形 （图2）。

2.1.3曲霉属（Aspergillus spp.）菌落为褐色或黄色颗粒状， 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞（足细胞）中垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊，从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗，小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端，呈辐射状排列或丛集成柱形，着色、形状、大小、纹饰变化很大（图3）。

2.1.4轮枝霉属（Verticillium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，周围有褐色颗粒物长出，后期有白色棉絮状菌长出，背面接种处黑色，周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色，后渐暗，棉絮状，背面黑色。分生孢子梗细长，轮生分枝。分生孢子为梗孢子，卵圆形或椭圆形，褐色，单胞，单生或顶生成小的潮湿簇，成向基的链（图4）。

2.1.5瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）菌落生长早期呈灰绿色，凝聚灰绿色粉状物质，后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色，棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形，成向基的链，有2种形态（图5）。endprint