不同取材时期和处理方法对瓦松无菌体系建立的影响

李庆伟　梁明勤　樊亚敏　刘荣宁　贺爱利

摘要：以瓦松植株为外植体进行组织培养，探索不同取材时期、处理方法、消毒时间、激素配比等对其无菌体系建立的影响，结果表明，无菌体系建立的材料以5月上旬取材、取材后对材料进行假植处理、剪去新萌生的茎段作为外植体为宜；材料用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min后接种，污染率在5%以下，存活率在92%以上；在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的启动培养基中，芽启动率为99.78%，外植体并没有出现愈伤组织、玻璃化等现象。

关键词：瓦松；取材时期；处理方法；无菌体系

中图分类号： Q945.52文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0055-03

收稿日期：2013-05-09

基金项目：河南农业职业学院重点项目（编号：HNAC2011KY002）。

作者简介：李庆伟（1979—），男，河南封丘人，硕士，讲师，研究方向为种苗繁育与大蒜生产。E-mail：liqingwei2003@163.com。瓦松（Orostachys fimbriatus）别称瓦花、瓦塔、瓦玉等，为景天科瓦松属2年生草本肉质植物，在河南、江苏等省及朝鲜、日本等国家和地区有分布[1]。瓦松植株中含有多种酸类、景天庚酮糖苷及异丙叉基景天庚酮糖苷等物质[2-5]，主要用于药物合成，目前，利用瓦松参与合成的药品不下27种。在临床上，主要用于治疗宫颈糜烂、肾性皮肤瘙痒、痔疮、口腔溃疡等症状[6-9]。随着研究深入，以瓦松为原材料加工而成的药品，将更多地应用在临床上。自然条件下，瓦松生存完全依靠自生自灭。近年来，由于受气候异常变化、花期采药、生境发生变化等影响，瓦松资源受到严重破坏，保护瓦松资源刻不容缓。目前，国内外并没有发现关于瓦松繁殖，尤其是快速繁殖的研究报道。探索并利用生物技术手段，对瓦松进行种苗繁育技术研究，对深度挖掘瓦松的潜在药用价值，进一步加快瓦松的开发利用具有十分重要的意义。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料采于当地农村15年以上的瓦房上，分别在2月上旬、5月上旬、7月上旬、10月上旬拔取全株瓦松，用带叶茎段作为接种材料。

1.2外植体消毒

采用2种外植体选择方法进行消毒。方法1为直接消毒接种：在自来水下清洗表面泥土与灰尘，后剪成3～5 cm长茎段，用自来水冲洗30 min，对2月上旬采集的材料，去根、留莲座状叶和芽，直接用水冲洗；置于超净工作台上用0.1% HgCl2分别浸泡2、4、6、8、10、12、14 min，无菌水冲洗4次，沥干水于无菌纸上。方法2为假植后消毒接种：材料假植于花盆中，套塑料袋，于室内25 ℃下培养5～7 d；剪新萌生嫩茎直接用0.1% HgCl2消毒，消毒时间同上。

消毒后茎段，剪成带叶的茎段接种于初代培养基中，每瓶接种1个茎段，每个处理均接种15瓶。

1.3材料培养

初代培养基，以MS培养基为基本培养基，采用2因素完全随机设计（表1）。培养基采用高压蒸汽灭菌，在121 ℃、1.1 kg/cm2 压力下灭菌15 min。接种材料置于温度24～26 ℃、光照时间14 h/d、光照强度 30 μmol/（m2·s） 的条件下进行培养。

1.4数据统计与分析

接种后2 d开始调查，后每隔3 d调查1次，记载污染发生的时间、类型、部位，外植体受伤害情况，腋芽初始萌动时间、腋芽萌动程度、材料的生理状态等，接种后22 d统计污染情况，接种后30 d统计材料存活、伤害情况、腋芽萌动等。根据统计结果计算污染率、存活率、启动率等，公式如下：污染率=污染外植体数/接种总数×100%；存活率=存活个体数/接种总数×100%；启动率=萌芽个体数/接种总数×100%。

数据用SPSS 13.0软件进行方差分析，采用邓肯氏新复极差测验进行多重比较。试验中全部处理小于1的百分数，经反正弦转换后，进行分析和比较。

2结果与分析

2.1取材时期和方法对无菌体系建立的影响

由图1可见，瓦松取材时期和方法不同，组培苗污染率存在很大差异；2月上旬取材后直接消毒接种（方法1）污染率最高，达100%，10月上旬、7月上旬取材次之；5月上旬取材污染率最低，2种方法平均污染率22.2%。这可能是由于5月瓦松种子萌动后刚开始大量生长，生命力较旺盛，且外植体在空气中暴露时间较短，随着在空气中暴露时间的增加，外植体表面汇集大量微生物，组织培养时直接进行消毒，并不能将表面的微生物全部杀死；进入冬季，瓦松植株为适应环境条件变化，进入休眠，整个植株生长停止，叶片紧紧闭合，体内积累大量微生物，消毒时，消毒剂只能将裸露在表面的微生物杀死，并不能杀死植株内的微生物，从而造成2月份污染率居高不下。从选用不同的外植体进行消毒接种看，在同一时期，直接消毒接种的组培苗污染率均高于假植后消毒接种的（方法2）。5月份是瓦松最佳的取材时期，外植体假植后，选取植株上萌生的新茎段作为外植体，可使组培苗污染率最低。

2.2消毒时间对无菌体系建立的影响

由表1可见，随着HgCl2消毒时间的增加，外植体的污染率明显降低；对于选用不同外植体进行消毒接种，方法1组培苗的污染率和HgCl2消毒时间成负相关性，消毒时间越长，污染率越低，2、4 min处理的污染率最高（100%），12、14 min处理的污染率最低（0），且外植体的存活情况不受影响，这说明外植体表面存在大量保护组织，能避免受伤害，方法2组培苗的污染率和HgCl2消毒时间也表现为负相关性，其外植体的存活情况（存活率）和消毒时间也成负相关关系，消毒时间越长，受伤害的外植体材料越多，存活率越低，这说明假植处理后，新萌生的茎段表面缺乏保护性组织；对于在相同的消毒时间条件下，方法2组培苗的污染率要明显低于方法1，这可能与二者的生长环境有关，方法1的植株长期暴露在自然环境下，其体表携带大量的微生物，而方法2新萌生的茎段，可能携带微生物含量少，但对于存活率，消毒时间较短时表现不明显，随着消毒时间的增长，方法2组培苗的存活率明显低于方法1，这可能与二者的生理状态有关，经过假植的瓦松苗组织相对更幼嫩一些。

综合瓦松外植体的污染率、存活率及其处理方法等指标，认为采用假植后剪取新生茎段，0.1% HgCl2浸泡10 min作为瓦松无菌体系建立外植体消毒的最佳时间。

为检验0.1 HgCl2消毒10 min对假植后新生茎段的效果，通过消毒较长茎段或消毒后每瓶接种多个材料进行验证（图2），发现材料的存活率在92%以上，污染率在5%以下。

2.3激素组成对瓦松外植体启动培养的影响

初代培养中以MS培养基为基本培养基，培养基中添加不同的浓度NAA和6-BA，瓦松外植体的启动培养结果如表2和图3所示。

从表2可以看出，瓦松的腋芽最早在接种1周后才开始萌动。腋芽的萌动时间受培养基中激素配比的影响而不同：培养基仅含有NAA时，芽的初始萌动时间随NAA浓度的增加而延长，在NAA浓度为0.5 mg/L时，接种后30 d，没有观察到腋芽萌动；仅含有6-BA的培养基，随6-BA浓度的增加，腋芽萌生时间也明显延迟，6-BA浓度为1.0 mg/L时，接种后30 d同样也没有发现腋芽萌动；当NAA和6-BA同时存在于培养基中，在培养基中6-BA浓度为0.1 mg/L，NAA浓度为0.1、0.3 mg/L时，瓦松腋芽萌动的时间都明显提早；培养基中6-BA浓度提高为 0.5 mg/L，无论培养基中NAA浓度是高是低，瓦松腋芽萌动的初始时间都明显提前，最早接种后8 d腋芽开始萌动；当培养基中NAA浓度为0.5 mg/L，6-BA 浓度为0.1、1.0 mg/L时，接种后30 d均没有观察到瓦松腋芽的萌发；培养基中不添加任何激素，腋芽初始萌生时间为接种后20 d。瓦松外植体在不同的培养基中，其腋芽的初始萌生时间呈现不同，这可能与所添加生长调节剂的特性有关：NAA是生长素类物质，能明显促进材料体内细胞的生长，它在低浓度时，可以促进材料不定根产生；浓度较高时，则会产生愈伤组织，抑制芽的发生。6-BA为细胞分裂素类物质，能促进细胞分裂，促进不定芽和丛生芽的形成；过高浓度时，会出现玻璃化等不良现象，抑制芽的发生。

另外，瓦松腋芽的启动率在添加一种激素的培养基中随添加激素浓度的增加而降低；在同时添加2种激素的培养基中，在6-BA浓度为0.1、0.5 mg/L时，随NAA浓度的提高，芽启动率降低；当6-BA浓度为 1.0 mg/L 时，NAA浓度过低（0.1 mg/L）或过高（0.5 mg/L）出现腋芽启动率反而没有 0.5 mg/L 的芽启动率高；培养基中不添加任何激素，瓦松的腋芽也全部萌发，芽萌发后生长缓慢，没有根系发生（表2）。

对各处理进行显著性分析发现，不同处理间达到显著水平，处理组合7（A2B3）和处理组合5（A2B1）极显著高于其他组合，处理组合16（A4B4）、13（A4B1）、4（A1B4）最差，处理组合8（A2B4）、14（A4B2）效果也比较差。

综合外植体接种后的萌生速度、启动率、生理状态等基本表现，瓦松初代培养的培养基以MS+NAA0.1mg/L+6-BA表2不同激素配比对瓦松外植体启动培养的影响

3小结与讨论

材料消毒是建立植物组织培养无菌再生体系的第一步，它直接关系到无菌体系能否建立，因此格外关键。许多研究指出，不同的植物种类、外植体类型、不同的生理状态及取材季节，所采用的外植体处理和消毒方式均不相同[10-14]。朱淑颖等在研究野生草珊瑚快繁体系建立时，发现直接使用消毒剂对外植体材料进行消毒，初代培养的污染率几乎为100%，其指出，选取的外植体材料源自野外的植株，叶表面孳生着大量微生物，并附着大量的霉菌孢子和细菌芽孢，甚至一些菌丝体进入表皮薄壁细胞，直接消毒难以奏效[10]。王丽萍等在进行番木瓜组织培养时，指出以大田番木瓜作外植体，很难控制污染，如果在番木瓜外植体使用消毒剂前用热水进行浸泡处理10 min，污染率同比降低了28.62%[11]。德庆措姆以西藏林芝地区野生银白杨萌蘖苗为材料，研究银白杨的消毒技术时发现，其体表密被白绒毛，直接影响消毒剂的渗入和减低消毒效果[12]。宋会访研究桂花的植物组织培养时，发现桂花茎段腋芽表面吸附大量杂菌，且枝条内部有内生菌存在，消毒难以控制，而新生的枝条和叶片中杂菌较少，容易消毒处理[13]。王延玲等在仙客来花药培养中，同样也指出材料表面的微生物难以消除彻底，不利于消毒处理[14]。本试验以野生瓦松茎段为外植体材料，比较了直接消毒接种和经过假植后剪新萌茎段接种2种处理方式对污染、存活率等的影响，发现假植后消毒虽能降低污染率，但材料的存活率大幅度下降，这和前人研究基本一致。主要原因是材料表面存在大量微生物，消毒剂难以将有些芽孢孢子杀死，通过假植后选取茎段，则能明显降低污染率，说明材料暴露空气中的时间越短，其携带微生物含量越少，也验证了前人的研究[12-15]。

瓦松为2年生植物，野生状态下，其生长状态受自然环境制约很大，华北地区春季3—4月多缺乏雨水，继而瓦松种子不能很好进行发芽产生新植株，1年生植株同时也因缺乏水分而生长受限，因此，应结合瓦松的生物学特性和环境条件来合理取材。马翠萍在1年中1月、3月、6月、9月、11月等5个时期分别对冬枣、一品红、杨树、樱桃、草莓进行取材研究，指出取材时应注意避免高温季节和材料的休眠期，尽量根据材料生物学特性和季节结合进行选择[15]，这和本试验结果基本相同。郭晓东以桃树1年生萌蘖和当年生上部枝条为试材，研究了3月、8月和11月取材对污染的影响，发现11月污染率最低、8月最高，但材料的启动率却以8月最高、11月

最低，综合分析以3月外植体作为材料最好[16]，这也说明瓦松的取材在考虑季节因素和生物学特性时，应结合试管苗的生理状态来判定最佳的取材时期。

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