应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

冯育芳, 邢 进, 巩 薇，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

研究报告

应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

冯育芳, 邢 进, 巩 薇，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

目的 建立有效的钩端螺旋体PCR检测方法，并对树鼩((tree shrew,Tupaiabelangeri))、长爪沙鼠(Merionesunguiculatus; Mongolian gerbil)和灰仓鼠(Cricetulusmigratorius)等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法 针对NCBI公布的钩端螺旋体序列，设计并筛选特异性引物，优化PCR体系，进行特异性和敏感性测试；并运用优化PCR方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果 成功建立钩端螺旋体PCR检测方法，序列测定验证了该方法的特异性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33%，普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100%，清洁级长爪沙鼠和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0%。结论 本研究建立了钩端螺旋体PCR检测方法，调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况，为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。

树鼩；长爪沙鼠；灰仓鼠；钩端螺旋体；PCR

钩端螺旋体病(Leptospirosis，简称钩体病) 是由钩端螺旋体(Leptospiraspp，简称钩体)引起的一种人兽共患的自然疫源性传染病[1]。该病的早期症状包括高烧、流口水、眼睛红肿及“茶色”尿液，如病菌入侵肾脏、肺和心脏可危及生命。我国钩端螺旋体病疫区分布广泛，主要分布在北纬25°～35°，东经100°～129°之间，也是长江流域的一些省份[2]。这些区域的鼠类或其他啮齿动物是钩体重要的传染源[1]。

近年来，伴随着医学研究的需要，实验动物家族逐步壮大；其中树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠基于其自身的生理和结构特点，成为生物医学研究中的新型实验动物。参照我国钩体病的地理分布情况[2]，发现这三种动物的来源地均处于钩体疫区，因此，对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠等新型实验动物进行钩体感染情况调查非常必要。钩体实验室检测常规使用血清学和分离培养方法，但是由于血清学方法需要的抗原较难获得，且建立稳定的血清学方法耗时较长。同时，钩体培养的实验室条件和技术要求较高，灵敏度较低，培养法很难达到理想的结果。因此，本文运用PCR方法对这三种实验动物的钩端螺旋体感染情况进行调查，有效缩短检测时间，提高检测灵敏度，可有效保证实验人员和实验动物的安全。

1 材料和方法

1.1 菌株

阳性菌株犬钩端螺旋体和爪哇群56660来源于本院，均为我国主要流行的钩端螺旋体菌株。

1.2 引物设计

根据文献和钩端螺旋体序列，在钩体保守基因secY区域共获得2对引物，详细信息见表1；Oligo 6软件验证可用，并委托Takara公司合成。

1.3 钩端螺旋体DNA提取

阳性钩体纯培养后直接提取DNA，DNA提取使用Qiagen的Dneasy Blood & Tissue Kit (Cat. No.69504)，详细操作根据产品说明书。

1.4 PCR扩增体系

PCR反应体系为20 μL，包括：10× buffer 2 μL, dNTP 1.6 μL, DEPC水 11.4 μL，引物各1 μL，Hs Taq酶1 μL，DNA 2 μL。通过实验对PCR反应条件进行优化，PCR产物进行琼脂糖电泳检测，并送Takara公司进行序列测定。

1.5 特异性测定

将该PCR扩增序列以及双向引物与GenBank上的序列进行BLAST比对，确定是否为特异性片段，阳性样本均送测序，并进行比对。

1.6 敏感性测定

阳性菌株纯培养后，按上述方法直接提取DNA，将提取的DNA倍比稀释为20 μg/mL、2 μg/mL、2.0×10-1μg/mL、2.0×10-2μg/mL、2.0×10-3μg/mL、2.0×10-4μg/mL、2.0×10-5μg/mL、2.0×10-6μg/mL、2.0×10-7μg/mL、2.0×10-8μg/mL、2.0×10-9μg/mL、2.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法进行测定，以确定其检测阈值。

1.7 样本来源及采集

全血样品共计224份，其中普通级树鼩全血样品60份(A单位)；长爪沙鼠全血样品104份，其中清洁级样品82份(B单位)，普通级样品22份(C单位)；清洁级灰仓鼠全血样品60份(D单位)。动物全血无菌采集，EDTA抗凝，吸取300 μL用于提取DNA，全血DNA提取方法如上。

2 结果

2.1 检测体系建立

为测试引物扩增效果及优化反应条件，以犬钩端螺旋体和爪哇群56660为阳性对照模板，通过实验对钩端螺旋体检测的引物进行筛选，结果Lep 12引物扩增结果较好，条带清晰，无杂带，与目的片段长短相符，测序结果证实为钩端螺旋体序列(图1)。最后确定Lep 12引物为本实验较为合适的检测引物。

通过温度梯度实验对PCR反应条件进行优化，最后确定最适反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，重复35个循环；72℃ 7 min(图2)。

表1 引物名称、序列及扩增片段Tab.1 The names, sequences and amplification fragments of the primers

图2 不同退火温度的扩增结果Fig.2 Results of the PCR amplification at different annealing temperatures

图3 敏感性试验Fig.3 The results of sensibility test

图4 普通级树鼩样本钩端螺旋体检测结果Fig.4 Results of PCR assay of 60 samples from conventional tree shrews

图5 清洁级长爪沙鼠样本钩端螺旋体检测结果Fig.5 Results of the PCR assay of 82 samples from clean Mongolian gerbils

为测定该PCR方法的敏感性，选取爪哇群56 660 DNA提取物，使用PCR水做10个稀释度，1～10为10倍系列稀释结果，从图3可见本实验方法最高可检测2.0×10-4μg/mL，灵敏度较好。

2.2 普通级树鼩钩体感染情况调查

60份普通级树鼩血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段，以检测是否存在钩体的感染。在这些样品中，共检出5个阳性标本(图4)。

2.3 清洁级长爪沙鼠钩体感染情况调查

从B单位获取的82份清洁级长爪沙鼠血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段，以检测是否存在钩体的感染。在这些样品中，均未检出阳性标本(图5)。

从C单位获取的22份普通级长爪沙鼠血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段。这些样品均为阳性标本，显示的条带深浅存在差异(图6)。由于普通级群体的感染情况较为复杂，因此，出现了杂带，但产物大小与目标序列一致，而且序列测定结果无误。

图6 普通级长爪沙鼠样本钩端螺旋体检测结果Fig.6 Results of the PCR assay of 22 samples from conventional Mongolian gerbils

2.4 清洁级灰仓鼠钩体感染情况调查

从D单位获得的60份清洁级灰仓鼠血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段，电泳结果显示，这60份样品中没有阳性标本(图7)。

图7 清洁级灰仓鼠样本钩端螺旋体检测结果Fig.7 Results of the PCR assay of 60 samples from clean gray hamsters

3 讨论

钩体病是人兽共患病，患此病的动物主要是啮齿类动物以及猪、犬和牛等家畜。小鼠感染钩体后发病轻微呈慢性带菌状态，而豚鼠作为钩体感染敏感动物表现为急性发病且可死亡。说明该病原能影响动物健康状况。而且，由于钩体能感染人类，早期症状包括高烧、流口水、眼睛红肿及“茶色”尿液，如病菌入侵肾脏、肺和心脏可危及生命。因此，实验动物该病原的调查和排除是非常重要和必要的。

树鼩，树鼩科树鼩属的动物，其许多分子和细胞结构近似于人类，且对多种人类重要病原易感，可作为重要人类病原的动物模型[3]；同时其在肿瘤学、内分泌学、神经生物学、生殖生物学、免疫学等方面的作用也得到科研人员的肯定，因此，树鼩作为一种新型的实验动物资源正越来越受到重视[4,5]。由于树鼩实验动物化时间较短，而且微生物净化难度较高，现有树鼩还是普通级；此外，本研究所检树鼩来源于钩端螺旋体病高发的西南亚区[2]，因此，树鼩存在钩端螺旋体的阳性动物较为正常，感染率为8.33%。

长爪沙鼠又称蒙古沙鼠，分类学上属于啮齿目、仓鼠科、沙鼠亚科、沙鼠属，由于其在多个方面独特的生物学特性，已被广泛应用于医学、生物学、行为学等多个生物学领域，是一种正在开发、有着广阔前景的多功能的实验动物[6, 7]。由于野生或普通长爪沙鼠存在多种严重病原，长期以来，为了提高长爪沙鼠种群的微生物与寄生虫质量控制水平，研究人员一直在筛选适合长爪沙鼠种群净化的代乳鼠，试图建立稳定的质量控制技术体系[8]。乔欣等人通过长期的技术服务实践，以ICR 小鼠作为长爪沙鼠剖腹产代乳鼠进行种群净化的应用研究取得了进展。代乳成活率超过50%，微生物学和寄生虫学检测均符合小鼠相关国家标准。代乳鼠与非代乳鼠其生长曲线没有差异[9]。因此，长爪沙鼠不同种群钩端螺旋体感染率存在显著差异。也从侧面说明长爪沙鼠微生物净化较为成功。

灰仓鼠在自然界参与土拉伦、森林脑炎、鼠疫等多种自然疫源性疾病传播[10]，并且对仙台病毒易感。而且，灰仓鼠已被用作鼠疫、包虫病、利氏曼病、肿瘤研究的理想的动物模型。我国现在已进行灰仓鼠实验动物化和生物净化[11]，因此，清洁级灰仓鼠的钩端螺旋体感染率较低，也说明该种群微生物净化效果较好。

本研究建立了钩端螺旋体PCR检测方法，调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况，为这三种实验动物的研究和使用奠定了基础。

[1] 于恩庶, 罗海波, 鲍行豪, 等. 钩端螺旋体病学 [M]. 北京: 人民卫生出版社， 1992.1-3.

[2] 时曼华, 屠云人. 我国钩端螺旋体病地理分布的研究 [J]. 中华流行病学杂志， 1995, 16(5):259-262.

[3] 黄晓燕, 徐娟, 孙晓梅, 等. 树鼩在人类疾病动物模型中应用研究进展 [J]. 实验动物科学， 2013,30(2):59-65

[4] 沈培清, 郑红, 刘汝文, 等. 中国树鼩实验动物化研究进展和展望 [J]. 动物学研究， 2011, 32(1):109-114.

[5] 角建林, 刘汝文, 陈丽玲, 等. 树鼩资源的开发利用与标准化研究——我国实验动物资源建设发展战略探讨 [J]. 中国比较医学杂志， 2009, 19(7):73-78.

[6] 冯育芳, 邢进, 王吉, 等. 普通环境长爪沙鼠肠道菌群的分离鉴定 [J]. 实验动物科学， 2012, 29(3):27-30.

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[10] 廖力夫. 灰仓鼠实验动物化研究 [J]. 中国实验动物学杂志，2002, 12(3):183-185.

[11] 侯岩岩, 麦丽开, 史深, 等. 灰仓鼠净化及生长发育指标测定 [J]. 实验动物与比较医学，2011, 31(4): 293-294.

Investigation ofLeptospirainfection in three new experimental animals by PCR methods

FENG Yu-fang, XING Jin, GONG Wei, YUE Bing-fei, HE Zheng-ming

(Institute for Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To establish an effective PCR assay for leptospirosis detection, and applicate the assay in tree shrew, mongolian gerbil and gray hamster. Methods Sequence of leptospira was obtained from the NCBI Genbank, and primers were designed based on the sequences. The positive amplified fragments were sequenced to verify the reliability of the method. The samples from tree shrew, mongolian gerbils and hamsters were tested using this PCR method. Results The PCR method for detection of leptospirosis was successfully established. The positive rate ofLeptospirawas 8.33% in 60 samples of conventional tree shrews, 100% in 104 samples of the conventional Mongolian gerbils, and 0% in 60 samples of clean gray hamsters. Conclusions The establishment of this PCR assay is useful in the detection of leptospirosis in tree shrew, mongolian gerbil and gray hamster. The results of our investigation of leptospira infection levels of the three new experimental animals may promote their application in biomedical research.

Tree shrew; Mongolian gerbil; gray hamster; leptospirosis; PCR

实验动物质量检测关键技术研究(2013BAK11B01)。

冯育芳(1981-)，女，助理研究员，硕士，研究方向：实验动物微生物检测，E-mail: fyf307@126.com。

贺争鸣 (1957-)，男，博士，研究员，研究方向：微生物学和免疫学。E-mail: zhengminghe57@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0031-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.008

2014-06-05