生长曲线法检测复方大果木姜子软胶囊的抗肿瘤作用

胡万福 杨燕

生长曲线法检测复方大果木姜子软胶囊的抗肿瘤作用

胡万福 杨燕

目的 研究复方大果木姜子软胶囊对肿瘤细胞Hep-2的拮抗作用。 方法 台盼蓝染色法及生长曲线法。结果 通过观察药物作用于细胞后对其正常生长曲线的影响, 发现药物作用于 Hep-2细胞后, 明显延长细胞正常生长的倍增时(TD2=3.245)从而抑制Hep-2的正常生长。 结论 复方大果木姜子软胶囊对肿瘤细胞Hep-2的生长具有明显的抑制作用。

复方大果木姜子软胶囊；台盼蓝染色；生长曲线；抗肿瘤作用

通常认为细胞膜丧失完整性, 细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。正常细胞能够排斥台盼蓝, 而死亡的细胞由于细胞膜的完整性丧失, 通透性增加, 细胞可被台盼蓝染成蓝色［1］。依据此原理, 细胞经台盼蓝染色后, 可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数, 实现对细胞存活率比较精确的定量分析。基于这一原理, 本文通过此方法证明复方大果木姜子软胶囊对肿瘤细胞Hep-2的生长具有明显的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞培养 Hep-2 细胞(贵阳医学院组织工程与干细胞中心提供)、在5%CO2, 37℃的细胞培养箱内培养, 用含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/ml), 链霉素(100 μg/ml)的RMPI1640培养液传代培养, 实验用细胞选择处于对数生长期的细胞。

1.1.2主要药品与试剂 复方大果木姜子软胶囊(贵阳中医学院制剂教研室提供)、喜树碱(武汉李时珍药业有限公司,批号：20120401)RPMI-1640培养基(Gibco公司产品)、新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)、DMSO为Sigma公司产品, 其余试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1实验用复方大果木姜子内容物的处理及给药浓度的确定 在保证用药剂量的前提下, 将药物制备为固体分散体,从而方便药物与细胞充分作用, 制备前后测定主要药物含量达到67.8%。临用前, 用含2%新生牛血清RMPI1640培养基稀释药物, 起始给药浓度为100 μg/ml；采用台盼蓝染色方法, 首先以100、10、1 μg/ml三个浓度进行药物初筛［2］, 根据初期实验结果, 确定以10 μg/ml为主进行药物作用后活细胞率(EC50, EC50=未染色细胞数/细胞总数×100%)值测定。设复方组、阳性组与空白组, 给药浓度(单位μg/ml)依次为16、8、4、2、1, 可以求得Hep-2作用于各组的EC50值分别为复方组7.382 μg/ml；对照组3.89 μg/ml。各给药浓度下细胞计数结果见表1。

表1 不同浓度下(单位μg/ml)细胞计数结果(n×104)及活细胞率(%)

1.2.2实验用细胞株的培养 根据Hep-2细胞株的生长特性, 取其复苏, 在37℃、5%CO2的培养箱内(饱和湿环境)培养, 培养基为含10%新生牛血清的RPMI1640培养基, 换液采取全换液方式进行, 洗液为Hank’s液待细胞长满后传代。

1.2.3实验过程 取处于对数生长期的Hep-2, 用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基配制为1×104/ml的细胞悬液, 在25 ml培养瓶中接种5 ml, 共接种21瓶, 分为正常组、药物组与阳性对照组(每组7瓶), 分别加入终浓度为EC50的受试药物与对照药物, 在给药2 h, 1、2、3、4、5、7 d时分别取样40 μl(取样时先用2.5%的胰蛋白酶将贴壁细胞充分消化), 加入0.4%的台盼蓝试剂10 μl染色后, 在显微镜下进行细胞计数, 以每天细胞计数结果的对数为纵轴, 以时间为横轴绘制细胞生长曲线, 对比观察药物对各实验细胞的生长抑制作用, 结果见表2及绘制的各实验组在不同实验条件下的细胞生长抑制曲线图, 见图1。

表2 药物作用于肿瘤细胞Hep-2后的不同时间细胞计数结果(n×104)

图1 药物对Hep-2细胞的生长抑制曲线

1.3统计学方法 采用SPSS11.5统计学软件处理数据。各实验组间比较和不同浓度条件下比较均采用齐性方差t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果及分析

依据药物作用于细胞倍增时(TD)公式：TD=0.301 t/(logNtlogNo)(t：培养时间, No：首次记下的细胞数, Nt：t时间后的细胞数)可以求得：空白组TD1=1.081；药物组TD2=3.245；对照组TD3=2.361。

通过上述数据分析可知：与空白组细胞正常倍增时(TD1=1.081)比较, 复方组作用于Hep-2细胞后可以明显的延长细胞的倍增时(TD2=3.245), 且作用强于对照组(TD3=2.361)；同时, 结果表明, 复方对Hep-2细胞的抑制作用是通过影响Hep-2细胞的正常生长周期而发挥作用。

药物对Hep-2细胞生长饱和密度的影响(NS)：从细胞生长抑制图中可以看出, 药物作用于Hep-2细胞后, 明显影响其正常生长, 细胞生长饱和密度显著降低, 与正常组细胞比较, 细胞生长达大坪期的时间与细胞数目显著降低, 但作用与喜树碱相比略差。

3 讨论

肿瘤已逐渐成为人类重大杀手之一。而中药复方抗肿瘤研究则是开发抗癌中药制剂研究的一个重要领域。但是如何在众多的单味中药中寻找出有效的抗癌药物呢？因此对中药抗肿瘤的筛选是其中的研究重点［3-5］。本研究立足于单味中药已有的现代药理研究成果, 结合传统中药复方配伍理论,深入挖掘民族医药精髓, 对研制开发的复方大果木姜子软胶囊进行抗肿瘤细胞研究。这些实验研究, 为进一步中药复方的体外抗肿瘤研究提供了实验依据。

本研究以Hep-2细胞株为筛选模型, 采用体外抑制肿瘤增殖的方法, 对复方大果木姜子软胶囊的药物有效部位采用台盼蓝染色法结合细胞生长曲线绘制从而直观的表明实验药物对Hep-2的生长抑制作用。

综上所述, 复方大果木姜子软胶囊对肿瘤细胞Hep-2的正常生长增殖具有明显的抑制作用, 进一步为该复方制剂的开发提供理论依据。同时结合实验用药物提取部位可知：脂溶性成分是其抗肿瘤作用的主要部位, 但对其中的抗肿瘤活性具体成分有待进一步研究。

［1］ 张卓然.实用细胞培养技术.北京：人民卫生出版社, 1999: 198.

［2］ 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社, 1990:661~693.

［3］ 吴剑, 滕国英.中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展 .国际医药卫生导报, 2007, 13(8):114-117.

［4］ 林建军, 曾金雄, 戴西湖.抗肝癌中药的生物学效应研究进展.中医药通报, 2005, 4(6):62.

［5］ 张艳琼, 黄利鸣, 吴江峰, 等.天花粉蛋白对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究.时珍国医国药, 2009, 20(10):2389-2390.

Anti-tumor effect of compound fructus litsea pungens soft capsule tested by growth curve method

HU Wan-fu, YANG Yan.
First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China

ObjectiveTo study the antagonism of compound fructus litsea pungens soft capsule on tumour cell Hep-2.MethodsTrypan blue and growth curve methods were applied.ResultsObservation of the influence of the drug on the normal growth curve of cell showed that the drug inhibited growth of cells by prolonging the normal growth multiplication (TD2=3.245).ConclusionCompound fructus litsea pungens soft capsule has obvious inhibiting effect on tumour cell Hep-2.

Compound fructus litsea pungens soft capsule; Trypan blue; Growth curve ; Antitumor effect

2014-05-13］

550002 贵阳中医学院第一附属医院(胡万福)；贵阳医学院组织工程与干细胞中心(杨燕)