不同基因型烟草叶片成熟过程中质体色素降解及相关酶活性变化

李丽华等

摘要：以不同烟草品种（系）云烟87、中烟100、豫烟10号、豫烟11号和8306中部叶片为材料，分析了烟叶成熟过程中质体色素降解和相关酶活性变化及其与烤后烟叶中性致香物质含量的关系。结果表明，在成熟过程中烟叶的质体色素含量呈下降趋势，叶绿素的降解量总体大于类胡萝卜素，且叶绿素a的降解量显著高于叶绿素 b。中烟100前期叶绿素合成较多，降解也较为迅速，但成熟后期降解缓慢；豫烟11号成熟期质体色素降解量较大，质体色素降解产物较高。脂氧合酶活性在烟叶成熟过程中呈现先升后降的趋势，且与类胡萝卜素的降解量呈极显著正相关。在不同烟草品种（系）间质体色素降解量及中性致香物质总量均表现为豫烟11号>豫烟10号>8306>中烟100>云烟87，品种间中性致香物质形成与质体色素的最大积累量无关，与质体色素的降解量有关，脂氧合酶活性较高、质体色素降解量大的品种（系）中性致香物质含量较高。

关键词：烟草；基因型；质体色素；中性致香物质

中图分类号：S572.01 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0065-04

烟草质体色素主要包括叶绿素（chlorophyll，Chl）和类胡萝卜素（carotenoid，Car）[1]，主要存在于烟叶细胞的细胞器质体中，是烟草生长过程中光合作用的重要物质，对改善烟叶品质和提高烟叶工业可用性具有重要意义[2-3]。质体色素是烟叶重要的香气前体物，其本身不具有香味特征，但通过分解、转化可形成对烟叶香气品质有重要贡献的香气成分[4]；烟叶质体色素的降解产物是所测定的中性致香物质中含量最高的，占中性致香物质总量的85%～96%[5]，其中类胡萝卜素降解产物的含量占8%～12%，对烟叶香气质量的影响较大[6]。不同基因型烟草质体色素的合成与降解量存在较大差异[7]。

前人研究认为，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）既是烟叶类胡萝卜素降解的关键酶[8]，又与烟叶叶绿素降解有关[9]。烟叶类胡萝卜素在LOX作用下氧化降解产生β-二氢大马酮、巨豆三烯酮、β-紫罗兰酮等致香物质[8]，LOX及其过氧化产物的氧化漂白作用使烟草叶绿素降解成新植二烯等致香物质[10]，但烟叶成熟过程中质体色素的降解及脂氧合酶的调控作用和与烤后烟中性致香物质含量的关系尚不明了。因此，本研究选取5个不同基因型烟草品种对烟叶成熟过程中质体色素含量、脂氧合酶活性变化及烤后烟叶中性致香物质含量进行分析，以揭示色素降解与烟叶香气物质含量的关系，并探讨烟叶成熟过程中脂氧合酶与质体色素降解的关系，为揭示浓香型特色优质烟叶形成机理和提高烟叶香气物质含量提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2012—2013年在河南省许昌市进行，以云烟87、中烟100、豫烟10号、豫烟11号和8306（遗传上稳定的品系）5个烟草品种作为参试材料。试验采用单因子完全随机区组设计，3次重复，每个小区种植面积330 m2，行株距为 120 cm×50 cm。5月2日移栽，按照大田优质烟叶生产管理方法管理。每个品种各选取整齐一致的单株，以第11张叶（自下向上数）为试验对象，在叶龄40、50、60、70、80 d（以幼叶长 1 cm、宽0.5 cm时作为叶龄1 d）取样测定质体色素（叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）含量和脂氧合酶活性，各项指标测定重复3次。

采用三段式烘烤工艺进行调制，各基因型烟叶在统一的烘烤环境中烘烤，按 GB 2635—1992《烤烟》进行分级，初烤烟样用于中性致香物质含量测定。

1.2 测定项目与方法

采用分光光度计法测定质体色素的含量[11]；脂氧合酶（LOX）活性参照文献[12]的方法测定。

采用内标法测定烟叶中性致香物质香气成分。中性致香物质提取及定性定量分析采用HP5890-5972气质联用仪。GC/MS分析条件如下：HP-5色谱柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm）；载气He，流速0.8 mL/min；近样口温度250 ℃；传输线温度280 ℃；离子源温度177 ℃；升温程序：50 ℃保持 2 min 后，以2 ℃/min的速度升至120 ℃，5 min后再以 2 ℃/min 的速度升至240 ℃，保持30 min；分流比1 ∶ 15，进样量2 μL；电离能70 eV；质量数范围50～500 amu；MS谱库为NIST02；采用内标法定量。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0数据处理系统和Microsoft Excel 2003软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同基因型烟草叶片叶绿素含量的动态变化

由图1、图2可知，不同基因型烟草叶片中叶绿素的含量动态变化趋势类似。叶绿素含量随成熟期的推进而逐渐下降，但品种（系）间含量存在差异，云烟87叶绿素a含量在叶龄40～60 d变化平稳，叶龄60～80 d呈直线下降趋势；豫烟11号、8306和豫烟10号较大幅度下降出现在叶龄50～60 d；叶绿素b在整个成熟过程中下降幅度小于叶绿素a，变化比较平缓。因此，在烟叶成熟期，叶绿素a和叶绿素b的比值虽大于1，但逐渐减小；同一叶龄不同基因型烟草叶片的叶绿素含量存在明显差异，中烟100叶龄40 d时含量最大，而在叶龄 50 d 时含量偏低，叶龄80 d时含量仍然最高，表明中烟100前期叶绿素合成较多，其降解也较为迅速，但成熟后期降解缓慢；叶龄80 d时豫烟10号叶绿素含量最少，仅为 0.172 mg/g；豫烟10号叶绿素降解量最大，为1.904 mg/g，云烟87降解量最小，为0.989 mg/g。

2.2 不同基因型烟草叶片类胡萝卜素含量的动态变化

由图3可知，不同基因型烟草叶片在叶龄40 d时类胡萝卜素含量均已达到最大值，随着成熟期叶龄增加，类胡萝卜素

含量呈现逐渐下降的趋势。不同基因型烟草叶片类胡萝卜素含量和变化动态有很大差异，中烟100在整个成熟过程中类胡萝卜素含量均最高，说明中烟100在成熟过程中类胡萝卜素降解较缓慢；除叶龄70～80 d时豫烟11号类胡萝卜素含量最少外，云烟87在整个成熟过程中含量最低；豫烟11号在叶龄40～50 d降幅平稳，叶龄50～60 d处于大量降解时期；8306在叶龄60～70 d降幅最大。不同品种（系）生长成熟期间类胡萝卜素降解量表现为豫烟11号>8306>豫烟10号>中烟100>云烟87，且豫烟11号烟叶叶龄80 d时类胡萝卜素含量最低，降解最为充分。

2.3 不同基因型烟草叶片脂氧合酶活性的动态变化

LOX是一种含非血红素铁的蛋白质，它专一催化含有顺，顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，生成具有共轭双键的过氧化氢物[13]。本试验结果（图4）表明，烟叶成熟过程中，脂氧合酶的活性呈现明显的倒“V”形特征；不同基因型烟草叶片脂氧合酶活性和变化动态有很大差异，在叶龄40～50 d时酶活性变化较平稳，叶龄50～60 d时酶活性迅速攀升且60 d出现最大峰值，之后迅速下降，8306脂氧合酶在叶龄70 d时仍保持较高活性；豫烟11号叶龄40 d时脂氧合酶活性最低，为2.76 D234 nm/（g·min），叶龄60 d时达到各品种最大值15.4 D234 nm/（g·min），说明该时期豫烟11号烟叶代谢比较旺盛，8306在整个成熟过程中脂氧合酶活性均较高。

2.4 不同基因型烟草叶片成熟过程中质体色素与酶活性的相关分析

不同品种（系）烟草叶片在成熟过程中叶龄间质体色素降解量与相同叶龄内脂氧合酶活性的相关分析结果表明，在整个生育期内脂氧合酶活性与类胡萝卜素降解量和总质体色素降解量均呈极显著（P<0.01）正相关，相关系数分别为 0.661* *、0.663* *，LOX对类胡萝卜素的降解起着至关重要的作用；脂氧合酶活性与叶绿素a和叶绿素b的降解量呈正相关，但未达显著水平（相关系数0.404、0.203）（表1），因此LOX的作用对不同品种（系）烟草叶片成熟过程中叶绿素的降解很重要，但LOX可能不是叶绿素降解唯一的关键酶。

利用GS/MS方法从烤后烟叶中分离鉴定出15种类胡萝卜素降解产物，主要有β-大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮等，在15 种类胡萝卜素降解产物中，以 β-大马酮的含量最高。不同基因型烟草叶片中所含类胡萝卜素降解产物的种类相同，但各品种（系）类胡萝卜素降解产物含量却有所差异，各处理类胡萝卜素降解产物的总量大小顺序为豫烟11号>豫烟10号>云烟87>8306>中烟100，且 豫烟11号是中烟100的1.40倍。香气物质总量与新植二烯含量顺序相同，为豫烟11号>豫烟10号>8306>中烟100>云烟87。

3 结论与讨论

质体色素（叶绿素和类胡萝卜素）是影响烟叶品质和可用性的主要成分之一，它不仅决定了调制后烟叶的色泽，而且其相关降解产物与烟叶的香气质和香气量密切相关。因此，烟草生长成熟期和调制后质体色素的含量变化，将直接影响到烟叶制品的香气风格和工业可用性；深入研究不同基因型烟叶中质体色素的形成、转化和降解规律，阐明其降解产物与烤烟香气风格的形成关系，对提高烟叶香气质和香气量的烟草品种筛选与评价具有重要意义。

类胡萝卜素降解产物是构成烟叶香气质量的重要组分。许多类胡萝卜素降解产物已是烤烟中确定的重要香气成分，它们产生香味的阈值相对较低，刺激性较小，香气质较好，对烟气香气贡献率大[15]，是形成烤烟细腻、高雅、清新香气的主要成分。韦凤杰等研究表明不同基因型烟叶质体色素含量随成熟进程的推进而逐渐下降[16]。本试验结果不同质体色素变化规律与其基本相同，但降解量有明显差异，叶绿素a的降解量大于叶绿素b，类胡萝卜素降低幅度总体小于叶绿素；不同基因型烟叶质体色素及其降解产物含量有一定的差异，豫烟11号成熟期质体色素降解量较大，质体色素降解产物较多，中烟100生长过程中质体色素合成虽然最多，但成熟和调制过程中没有充分降解，其质体色素降解产物最少，因为栽培措施和生长条件一致，所以质体色素的差异是由基因型决定的；不同基因型烟叶质体色素及其降解产物含量的差异也可能是导致不同烟草品种表现出不同的香味质量和风格的重要原因。

在烟叶烘烤中，LOX既是类胡萝卜素降解的关键酶[17-18]，又和叶绿素降解密切相关[19]，对烤烟的香气质和量有重要影响[10]。对于不同品种（系）烟草，LOX活性在烟叶生长成熟过程中均呈现先升后降的趋势，LOX活性与类胡萝卜素的降解量呈极显著正相关，这与文献[20-21]报道的类胡萝卜素降解与LOX活性呈显著正相关的结论完全一致，也与文献[17]等报道的LOX与烤烟类胡萝卜素降解呈高度正相关的结论相符；脂氧合酶活性与叶绿素a和叶绿素b的降解量的相关性没有达到显著水平（P>0.05），这与文献[22]报道烟叶烘烤中LOX活性与叶绿素降解速率均呈显著正相关的结论不完全一致，但与文献[23]结论一致，可能是LOX活性与叶绿素降解的相关特征与烟草品种、温度、成熟度[14]等多种因素有关，需要作进一步研究。因此，在烟叶成熟过程中，LOX对类胡萝卜素的降解起着至关重要的作用，但可能不是叶绿素降解的关键酶。对于不同基因型烟草叶片在成熟过程中的质体色素降解，LOX可能主要作用于类胡萝卜素而不是叶绿素。

品种间中性致香物质形成与质体色素的最大积累量无关，而与其质体色素的降解量有关，质体色素降解量大的品种（系）中性致香物质含量较高。在烟叶生长过程中，促进质体色素的积累，而在成熟和调制过程中促进烟叶质体色素的充分降解，提高色素降解量，将有利于促进烟叶香气物质的形成，提高烟叶的香气品质。

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