一种基于BODIPY的Zn2+荧光探针：ICT增强效应

邱 琳 季一凡 朱成成 陈韵聪 何卫江＊, 郭子建＊,

(1南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室，南京 210093)

(2常州大学制药与生命科学学院，常州 213164)

作为人体内最重要的过渡金属离子之一，锌离子不仅参与了神经信号传递、基因转录、信号转导和免疫反应等生理过程[1-2]而且还与许多疾病如老年痴呆症、糖尿病、前列腺癌等的病理过程相关[3-5]。利用荧光探针检测锌离子在生命体系中的实时分布信息对理解这些相关过程具有重要的意义，因此发展锌离子荧光探针是目前研究的热点之一[6]。除了紫外激发的经典探针TSQ系列外[7],目前报道较多的Zn2+探针主要有ZP系列[8]和ZnAF[9]系列，也是目前最为成功的锌离子探针。这两类探针均基于荧光素而设计，一般激发在490 nm左右，发射在520 nm左右。显然发展具有更长激发和发射波长的锌离子荧光不仅有利于进行各类细胞共染造影，而且有利于降低自发荧光、光毒性及光漂白等短波长造影中的不足。

用于探针设计的典型荧光团有荧光素[9-11]、萘酰亚胺[12-14]、香豆素[15-16]、川菁[17-18]、罗丹明[19-21]以及氟硼吡咯[22-23](4-difluoro-4-borata-3a-azonia-4a-aza-s-indacene，BODIPY)等。其中BODIPY类染料分子有较高的刚性和芳性，因此该类染料具有良好的光稳定性、较高的摩尔消光系数和荧光量子产率。由于这类分子还具有发光性能环境依赖性小、吸收及发射带较窄等优点，因而基于BODIPY的探针设计报道较多[24-25]，以BODIPY来构筑锌离子荧光探针有利于降低光漂白延长造影时间，并为各类共染造影和不同激发光源配置的造影设备提供更多的选择。然而常见 BODIPY探针 Stokes位移较小(＜20 nm)，易造成激发干扰。它们的激发波长一般在500 nm左右，与荧光素类探针的激发过于接近，共染时易发生相互影响。BODIPY通常发出绿色荧光，波长在510 nm左右的，较易受到自发荧光干扰。根据Rurack等人的报道，BODIPY类荧光团α-位进行推电子基取代苯乙烯修饰，不仅可明显增强BODIPY分子内存在的ICT效应，而且能显著提高BODIPY荧光团的吸收和发射波长、增加斯托克斯位移[26]。这些均有利于进一步降低造影中的自发荧光干扰、光毒性和激发干扰。据此我们设计了一个新的基于BODIPY的Zn2+荧光探针 BDP-m-BPA(图 1)。在探针分子中meso-位引入了将对位氨基修饰为Zn2+螯合团bis(2-pyridylmethyl)amine(BPA)[27-28]的苯环。其中BPA基团的氨基将对BODIPY荧光团的荧光具有PET淬灭效应[28]。BPA与Zn2+配位将导致PET效应的阻断并诱导探针分子的荧光增强，实现对Zn2+的增强响应。α-(4-羟基)苯乙烯的引入可扩展分子的共轭体系并促进ICT效应以提高探针的激发和发射波长并增大Stokes位移。

图1 探针BDP-m-BPA的合成路线Fig.1 Synthesis of sensor BDP-m-BPA

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

合成中常用试剂和溶剂均为国内商业试剂，其中二氯甲烷经CaH2干燥后使用，甲苯经钠/二苯甲酮回流干躁后使用，其余试剂未做纯化。三氟乙酸(TFA)和 2，4-二甲基吡咯购自 Alfa公司。N，N，N′，N′-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)，Zn(NO3)2，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和用于光谱及造影测试中的各类无机盐均为来自Aldrich和Alfa的分析纯试剂。光谱测试中所用溶剂如乙醇等为Aldrich光谱纯试剂，水为经MILIPORE处理的超纯水。电喷雾质谱用LCQ电喷雾质谱仪(Thermo Finnigan)测定，并用ISOPRO 3.0程序模拟其同位素分布模式。探针分子高分辨质谱用 Agilent 6540Q-TOF HPLC-MS测定。1H，13C NMR在Bruker DRX-500或Bruker DRX-600核磁仪上用标准脉冲序列测定 (298 K))。紫外光谱用PerkinElmer Lambda 35紫外可见光谱仪测定。荧光光谱在Horiba Scientifc Fluoromax-4发光光谱仪上测定。pH值用PHS3精密pH计记录。

1.2 荧光配体BDP-m-BPA的合成

1.2.1 化合物 2 的合成

化合物1采用文献报道的方法[29]。氮气保护下将化合物 1(0.303 g，1 mmol) 和 2，4-二甲基吡咯(0.190 g，2 mmol)用 50 mL 无水二氯甲烷溶解，加入一滴TFA后室温搅拌[30]。TLC跟踪至化合物1反应完全。加入无水二氯甲烷溶解的DDQ(0.220 g，1 mmol)后继续搅拌30 min。随后加入2 mL无水三乙胺搅拌5 min，继续加入2 mL BF3·Et2O搅拌1 h。将混合物用饱和食盐水洗涤一次后以无水硫酸钠干燥有机层，硅胶柱层析分离(200～300 目，VCH3OH∶VAcOEt=1∶10)得到橘色固体 102 mg，产率 20%。1H NMR(300 MHz，CDCl3) δ=1.47(s，6H)，2.56(s，6H)，4.91(s，4H)，5.97(s，2H)，6.82(d，J=8.5 Hz，2H)，7.02(d，J=8.5 Hz，2H)，7.23(m，J=12 Hz，2H)，7.27(d，J=8 Hz，2H)，7.67(t，J=15 Hz，2H)，8.63(d，J=4.5，2H)。

1.2.2 化合物 3 合成

氮气保护下将化合物 2(0.240 g，0.46 mmol)，对羟基苯甲醛(0.060 g，0.50 mmol)，0.10 mL 哌啶，少量4A分子筛，一起置于5 mL无水甲苯中混合加热至110℃并维持24 h[30]。冷却至室温后蒸干溶剂，残余物经硅胶柱层析分离 (200～300 目，VAcOEt∶VMeOH=20∶1)得到深紫红色固体60 mg,产率21%。1H NMR(500 MHz，CD3OD) δ=1.45(s，3H)，1.50(s，3 H)，2.50(s，3H)，4.95(s，4H)，6.02(s，1H)，6.69(s，1H)，6.83(d，J=10 Hz，2H)，6.87(d，J=10 Hz，2H)，7.03(d，J=8 Hz，2H)，7.31(m，J=35 Hz，3H)，7.37(d，J=8 Hz，2H)，7.44(m，J=25 Hz，3H)，7.79(t，J=15 Hz，2H)，8.55(d，J=5 Hz，2H)。

1.2.3 目标化合物BDP-m-BPA的合成

60 mg化合物3加入2 mL醋酸酐加热至50℃，维持8 h后结束反应[31]。减压蒸干溶剂，用二氯甲烷洗涤得到深蓝色固体，产率90%。1H NMR(600 MHz，CDCl3) δ=1.37(s，3H)，1.41(s，3H)，2.58(s，3H)，3.99(s，3H)，4.90(s，4H)，5.99(s，1H)，6.59(s，1H)，6.73(d，J=12 Hz，2H)，7.20(m，J=42 Hz，3H)，7.26(d，J=12 Hz，2H)，7.46(m，J=42 Hz，5H)，7.67(t-d，J=24 Hz，6 Hz，2H)，8.19(d，J=12 Hz，2H)，8.67(d，J=6 Hz，2H)ppm。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ=14.44，14.64，14.80,29.71,55.37,56.49,112.87,115.59,117.87,120.99,121.90,126.46,128.76，129.38，130.26，130.71，130.90,132.49,136.99，138.73，140.18，141.17，142.40,148.11,148.36,154.45,154.20,157.40,166.53。HRMS(EI)(positive mode，m/z)：Calcd.668.300 3，Found 668.301 5 for[M+H]+。

1.3 BDP-m-BPA的荧光、吸收光谱及其Zn2+滴定测试

取BDP-m-BPA的乙醇储备液加入到100 mL的容量瓶中并用Tris-HCl缓冲溶液 (20 mmol·L-1，pH=7.20) 和乙醇定容，配成浓度为 10 μmol·L-1的(VC2H5OH∶Vwater=1∶1)溶液进行吸收和荧光光谱测量。吸收光谱和荧光光谱滴定均通过向3 mL BDP-m-BPA溶液中分别加入等分体积的Zn(NO3)2水溶液(1.2 mmol·L-1)完成。每次加 3 μL，充分混匀后进行紫外和荧光测试。

1.4 BDP-m-BPA对不同金属离子的荧光响应

探针对金属离子选择性荧光响应能力测试及Zn2+在其他金属离子存在下的竞争性荧光响应实验均在前述介质中进行。实验中向3 mL探针(10 μmol·L-1)溶液中加入 15 μL 浓度为 12 mmol·L-1的金属离子水溶液 (金属离子总浓度为探针浓度的6倍)，充分混匀后进行测试。竞争响应研究中向3 mL探针 (10 μmol·L-1) 溶液中加入 15 μL 浓度为 12 mmol·L-1的Zn(NO3)2水溶液，充分混匀后记录光谱。然后再向此溶液中加入15 μL浓度为12 mmol·L-1的其他金属离子或6 μL浓度为1 mol·L-1的碱金属或碱土金属离子溶液，混匀后记录光谱。

1.5 BDP-m-BPA的线性响应范围及检测限测定

测试在含 1 μmol·L-1BDP-m-BPA 的 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)中进行。向3 mL探针溶液中分别加入Zn2+水溶液(0.12 mmol·L-1)，每次加 3.0 μL，充分混匀后进行荧光测试。检测限测试先扫描背景11遍，获得标准偏差σ。检测限利用3σ/S求出，其中S为线性响应范围内的斜率。

1.6 BDP-m-BPA量子产率的测定

配体溶液为 1 μmol·L-1的 Tris-HCl溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)。罗丹明 B 作为为基准物(Φf=0.97，C2H5OH)，把基准物的吸光度和待测物激发波长处的吸光度调整到0.1以下，以527 nm为共同激发波长，对各溶液分别进行紫外吸收测定与荧光光谱测定，结果取3次平均值。所得数据代如下列公式进行计算[32]：

公式中F为荧光发射光谱的积分面积，A表示所用激发波长的吸光度，n为样品溶液的折射系数，下标R与S分别代表基准物与样品。

1.7 BDP-m-BPA与Zn2+的结合常数测定

结合常数的测定实验在含不同Zn2+浓度的溶液中进行。溶液中探针BDP-m-BPA的浓度固定为10 μmol·L-1。BDP-m-BPA 的 Zn2+结合常数可根据下式进行拟合[33]：

其中I0是不加Zn2+时BDP-m-BPA在580 nm处荧光强度，I是不同Zn2+浓度时BDP-m-BPA在580 nm处荧光强度。

1.8 BDP-m-BPA的胞内分布和胞内Zn2+造影

造影实验中所用HeLa细胞在含有10%胚胎小牛血清(FCS，Invitrogen)、青霉素(100 units·mL-1)和链霉素 (100 mg·mL-1) 的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)培养基中培养，环境为37℃含5%CO2的空气。HeLa细胞培养在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，去掉介质后，细胞用不含金属的PBS溶液洗涤3次。细胞染色及胞内Zn2+成像实验步骤如下：把BDP-m-BPA乙醇储备液稀释到不含金属的PBS溶液中，使其最终浓度为10 μmol·L-1。以此溶液室温孵育HeLa细胞30 min。去除探针溶液后再用不含金属的PBS溶液洗涤3次，然后用激光共聚焦荧光显微镜进行造影。细胞外源锌的引入利用 ZnSO4/吡啶硫酮(10 μmol·L-1，通过 PBS 稀释相应5 mmol·L-1储备液获得)溶液孵育30 min完成，随后再次进行荧光造影。造影完毕后，细胞再用50 μmol·L-1TPEN(由TPEN的浓储液通过 PBS稀释得到)处理30 min后，再用PBS洗涤一次后进行造影。造影均在Olympus IX81激光共聚焦荧光显微镜上完成。激发波长为543 nm,成像通道为560～590 nm。

2 结果与讨论

2.1 BDP-m-BPA的Zn2+荧光和吸收光谱滴定

荧光光谱测定发现自由BDP-m-BPA发射光谱显示2个以575和660 nm为中心的发射峰，其中后一发射峰较宽。随化合物浓度的增大，前一发射峰几乎不变，而后一发射峰增强明显，具有受激缔合发射峰的特点 (图2)，在无α-(4-羟基)苯乙烯结构的BODIPY荧光团中无此发射峰，显示该结构的引入促进了分子间的缔合作用。前一发射峰可指认为BODIPY母体的本征荧光发射。探针的激发光谱显示化合物具有多个激发峰，其中以527 nm为中心的激发峰波长较长，激发效率适中且不与发射干扰，在后续光谱研究中被选为激发波长。该探针的本征发射峰较普通BODIPY荧光团红移了近60 nm，而受激缔合发射已靠近近红外发射窗口。激发和发射的向红变化，这与α-(4-羟基)苯乙烯结构引入扩展了共轭体系、促进分子内ICT效应以及分子缔合有关[26]，有利于降低造影中的自发荧光干扰和光毒性。另外本征发射的Stokes位移达到53 nm，也远大于普通BODIPY的Stokes位移(＜20 nm)。对受激缔合发射发射来说Stokes位移更达到133 nm。Stokes位移的增大也有利于减少激发光的干扰。除了300～450 nm间若干个小的吸收峰外，BDP-m-BPA的最大吸收峰出现在596 nm，相对摩尔吸光系数为6.30×104L·mol-1·cm-1。该吸收带还存在一个位于566 nm的不明显的肩峰。BDP-m-BPA在596 nm处的最大吸收峰可归属为ICT效应导致的吸收峰，比较一般 meso-苯基-1，3，5，7-四甲基取代的 BODIPY的最大吸收(～500 nm)[34]，探针将近100 nm的吸收峰红移同样可以认为源于α-位的对羟基苯乙烯基取代增强了分子的ICT效应[26,30]。

图2 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)中的荧光激发(λem=580 nm)和发射光谱(λex=527 nm)Fig.2 Excitation(λem=580 nm)and emission(λex=527 nm)spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)

图3 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的荧光滴定图谱Fig.3 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

在Tris-HCl溶液中的Zn2+荧光滴定结果表明(图 3)，不断加入 0.1 倍量的 Zn2+将导致 BDP-m-BPA发射光谱中相对较弱的575 nm处的发射峰不断增强，并且出现微小的红移。Zn2+的加入对其ICT发射峰影响不明显。Zn2+对本征发射峰和ICT发射峰的不同影响显示该化合物对Zn2+有一定的比例计量响应行为。然而Zn2+加入量较大时本征发射峰增强后会导致与ICT发射峰明显交叠，使得后者逐渐成为不明显的肩峰，因此比例计量效应受到干扰，探针主要体现Zn2+增强响应。根据580 nm处探针荧光强度给出的Zn2+滴定曲线表明探针的荧光随着Zn2+的加入持续增强，虽然荧光增长率在加入6倍探针量的Zn2+后已较小，但未达平衡，这也表明Zn2+与探针的结合能力不强。在紫外光照射下BDP-m-BPA溶液发出红色荧光，加入6倍探针量的Zn2+之后溶液立即转为发出黄色荧光，这一现象也表明探针分子对Zn2+的荧光识别可以通过肉眼观察来实现(图4)。研究表明探针分子在527 nm光源激发下的量子产率为0.023，而加入6倍Zn2+后可导致BDP-m-BPA的量子产率升高到约为0.16。

图4 紫外灯照射下 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中对 Zn2+的荧光响应Fig.4 Photograph of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)uopon irradiation by UV lamp of 365 nm

Zn2+荧光滴定结果表明BDP-m-BPA与Zn2+结合主要诱导本征发射强度的增强并逐渐覆盖基本不变的受激缔合发射峰，BDP-m-BPA主要表现为荧光增强型探针。一般在BODIPY衍生物中，meso-位芳环与BODIPY荧光团既不共面也不共轭有关[35]，因此Zn2+离子与meso-芳香氨基配位并不会影响探针分子的受激缔合作用。同时由于meso-芳香氨基与BODIPY的隔离使得BPA螯合团对BODIPY存在PET淬灭效应，因此Zn2+导致的探针本征荧光发射增强应源于BPA与Zn2+配位阻断PET效应。

紫外滴定实验表明Zn2+的加入对596和566 nm两处的吸收峰仅有非常微小的影响(图5)。由于meso-位芳香取代基与BODIPY母体结构既不共面也不参与共轭，因此Zn2+与meso-苯环对位BPA配位不会明显影响BODIPY母体中的ICT效应。

图5 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的紫外-可见吸收光谱滴定图Fig.5 UV-Vis spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

2.2 BDP-m-BPA与Zn2+的结合方式

由于探针与Zn2+的结合能力较弱，不易通过简单的荧光滴定曲线获得Zn2+结合比例的有效信息。实际研究中首先通过测定Tris-HCl缓冲溶液中Zn2+与探针的荧光工作曲线来确定探针的Zn2+结合比例。固定BDP-m-BPA和 Zn2+的总浓度为 30 μmol·L-1，通过改变Zn2+与BDP-m-BPA的比例得到不同比值下体系的荧光光谱图(图6)。根据580 nm处荧光强度得到的工作曲线显示荧光强度最大值出现在Zn2+与总浓度比值为0.5处。这一结果表明BDP-m-BPA与Zn2+是以1∶1的计量比结合的。

研究同时还用电喷雾质谱对BDP-m-BPA与Zn2+的配合物进行了研究。如图7所示，等物质的量混合的BDP-m-BPA和Zn2+混合液的正离子电喷雾质谱显示两个主要信号峰，其最高丰度质荷比分别为668.50和790.33。两信号的同位素分布模式分别与ISOPRO 3.0给出的物种[BDP-m-BPA]+和[BDP-m-BPA+Zn2++AcO-]+的质谱同位素分布模式基本一致，因此可将这两个质谱信号分别指认为这两个物种。该结果一方面证实探针BDP-m-BPA与Zn2+是以1∶1的计量比配位结合的，另一方面虽然电喷雾质谱信号丰度不能完全对应溶液中的浓度，但探针本身明显的质谱信号表明溶液中还存在较多的自由探针分子，这也暗示探针与Zn2+的结合能力一般。

图6 根据580 nm处荧光强度测定的BDP-m-BPA与Zn2+结合的工作曲线Fig.6 Job plot of BDP-m-BPA-Zn2+complex in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm upon excitation at 527 nm

图7 BDP-m-BPA与Zn2+1∶1混合液的电喷雾质谱图Fig.7 ESI-MS spectrum of mixture solution of BDP-m-BPA and Zn2+(1∶1)

为测定BDP-m-BPA与Zn2+的结合常数，根据580 nm处的荧光强度研究中测定了探针结合Zn2+的BenesiHildebrand图(图8)。利用公式1对测得的BenesiHildebrand图进行线性拟合，获得拟合直线的斜率和截距，由此计算得到 Ka值为～5.4×105L·mol-1(Kd，～1.8 μmol·L-1)。在已报道的以 BPA 为 Zn2+螯合团的Zn2+探针中，以荧光素为荧光团的NG-PDX的Kd值 30～40 μmol·L-1[36],以简单 BODIPY 为荧光团的 BDA 的 Kd值为 0.1 nmol·L-1[37]，以七甲川菁为荧光团的DPA-Cy的Kd值为60 nmol·L-1[18]。显然不同的结构组合可以导致BPA螯合团具有不同的Zn2+结合能力。与BDA探针(BPA螯合团氨基氮原子直接连接在meso-C位)相比，BDP-m-BPA中meso-位苯环与BPA氨基氮共轭，降低了其氨基的配位能力，也导致了整个分子的Zn2+结合能力降低。不过由于人体内不同环境的自由Zn2+浓度范围较大，从pmol·L-1一直跨到 300 μmol·L-1[1]，需要 Zn2+结合能力不同的探针来检测不同浓度的Zn2+，而BDP-m-BPA正好可以满足～μmol·L-1水平 Zn2+的检测。

图8 BDP-m-BPA在Tris-HCl缓冲液中(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH∶VH2O=1∶1)结合 Zn2+的 Benesi-Hildebrand图;根据580 nm处荧光测定,激发波长527 nmFig.8 Benesi-Hildebrand plot of BDP-m-BPA binding Zn2+in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm;λex=527 nm

2.3 BDP-m-BPA对不同金属离子的荧光响应

BDP-m-BPA对不同金属离子的荧光选择性响应能力如图9所示。除Zn2+(6 equiv)对BODIPY本征发射峰有明显的荧光增强响应外，同族Cd2+和Hg2+(6 equiv)的荧光增强响应非常微弱，而其他测试金属离子 Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each) 以及Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each)均对探针的荧光光谱无明显影响。Cu2+仅显示对受激缔合发射峰的淬灭效应，对本征发射峰无明显影响。这些结果表明该探针对Zn2+具有较好的特异性增强响应能力。

为研究BDP-m-BPA在复杂环境中对Zn2+的荧光检测的能力，我们还测试了在其他金属离子存在时探针对Zn2+的增强响应能力。结果发现共存金属离子如 Hg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each)以及 Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each，图 10中mix)均对探针的Zn2+荧光增强响应无明显干扰。Cu2+的存在导致Zn2+诱导的荧光增强效应很小，这可能是由于Cu2+与BPA的结合能力较强，Cu2+、Zn2+共存时Zn2+与探针分子的BPA难以有效结合。以上结果表明BDP-m-BPA可以在含水溶液环境中对Zn2+实现荧光选择性响应。由于生命体系中“自由”Cu2+的浓度远低于“自由”Zn2+浓度，因此造影中不会对Zn2+检测造成明显的干扰。

图9 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中对不同金属离子的荧光响应;Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+各自量是探针的 6倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,其中各离子的量为探针的200倍,λex=527 nmFig.9 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)in the presence of different metal cations;λex=527 nm

低浓度下(1 μmol·L-1)的锌离子荧光滴定实验表明BDP-m-BPA在Tris-HCl缓冲溶液中对Zn2+的检测限(LOD)为 0.18 μmol·L-1，其线性检测范围为0.12～1.2 μmol·L-1。由于人体自由锌离子浓度范围为 pmol·L-1到 0.3 mmol·L-1，目前显示的检测性能表明探针BDP-m-BPA具有合适的灵敏度和良好的线性响应范围，适合于～μmol·L-1水平自由Zn2+的检测。

2.4 BDP-m-BPA荧光对pH的依赖性

图10 金属离子共存时Tris-HCl缓冲溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1) 对 Zn2+的增强响应;Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+的含量是探针的 6 倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,各自含量分别是探针的200倍;I580,580 nm处荧光强度。黑色为探针加标记金属离子时数据,灰色为探针加标记金属和Zn2+时数据;Blank指探针及其加Zn2+时数据Fig.10 Fluorescent response of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1 ∶1)to Zn2+in the presence of other metal cations;Final concentration for Zn2+,Ag+,Pb2+,Cd2+,Co2+,Fe3+,Cr3+,Hg2+,Mn2+is 60 μmol·L-1each,for Mix,Na+,K+,Ca2+,and Mg2+were added simultaneously and the final concentration for each is 2 mmol·L-1;I580,emission at 580 nm;black bar,data in the presence of the indicated metal cation;gray bar,data in the presence of Zn2+and the indicated metal cation;Blank,the data for free sensor and sensor in the presence of Zn2+

为探讨BDP-m-BPA在生物造影中的适用性，我们还进一步研究了其荧光对pH的依赖性。为此分别测定试了探针在不同pH值的C2H5OH/H2O(1∶1，V/V)混合溶液中的荧光强度。图11(a)显示了探针在不同pH介质中在580 nm处荧光强度。BDP-m-BPA 在 pH 7.0～12.4范围内荧光强度较弱也比较稳定。当pH＜7.0时，探针的荧光随pH降低略有增强，然而在pH6.0以上pH对荧光的影响仍然较小。在pH6.0以下pH降低诱导的荧光逐渐变得明显，表明BPA氨基质子化导致BPA对BODIPY荧光母体的PET淬灭效应被阻止。上述pH荧光响应行为表明该探针是一个PET探针，低pH值下氨基质子化诱导荧光增强是PET探针的典型表现[27]。正是BDP-m-BPA探针的PET型响应特点导致Zn2+配位的荧光增强效应。BDP-m-BPA/Zn2+配合物在不同pH条件下的荧光测定 (图11b)表明该配合物在pH 6.33～7.62范围内显示相对稳定的荧光增强效应，pH高于或低于该范围则荧光强度迅速降低。由于在近中性条件下探针荧光及其Zn2+增强效应无pH依赖性。而生命体内大多数微环境的pH值不会偏离中性太多，因此在多数细胞和生物体微环境中BDP-m-BPA将显示稳定的荧光，不会干扰其Zn2+响应，因此BDP-m-BPA应较为适于细胞造影应用。

图11 (a)BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)和(b)BDP-m-BPA/Zn2+配合物(10 μmol·L-1)在 580 nm 处荧光强度随 pH变化图(VC2H5OH∶VH2O=1∶1);激发波长为 527 nmFig.11 Fluorescent pH titration profile according to the fluorescence intensity at 580nm;λex,527 nm

图12 BDP-m-BPA染色的HeLa细胞的激光共聚焦造影图;经BDP-m-BPA染色（10 μmol·L-1in PBS,25℃,30 min）的细胞明场图Fig.12 Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells stained by BDP-m-BPA(10 μmol·L-1in PBS,25 ℃,30 min)

2.5 BDP-m-BPA对细胞内Zn2+的造影性能

通过对探针染色的HeLa细胞进行激光共聚焦荧光成像进一步研究了BDP-m-BPA对细胞内Zn2+的造影能力。造影选用单通道模式完成，激发波长为543 nm，成像通道为560～590 nm。将HeLa细胞在BDP-m-BPA 溶液中(10 μmol·L-1)中 25 ℃下孵育 30 min，以PBS洗去探针溶液进行细胞造影(图12b)。荧光图像显示在细胞浆中存在点状分布的荧光区域，一些靠近细胞核的区域具有更高强度的荧光。细胞核中未见明显的荧光分布。未经探针染色的细胞无论是胞浆还是细胞核中均未见明显的荧光分布。这表明BDP-m-BPA探针具有良好的细胞膜透过能力，10 μmol·L-1溶液 25 ℃孵育 30 min 可以有效实现细胞的染色。为确认探针在细胞中对Zn2+的增强响应，随后分别研究了染色细胞在导入外源Zn2+和脱除Zn2+时的造影效果。外源Zn2+的导入是利用ZnSO4/吡啶硫酮(1∶1，10 μmol·L-1)溶液对染色细胞进行进一步孵化(30 min)实现的[38]。造影发现胞浆中荧光发生明显增强(图12c)，表明胞浆中探针分子可有效对胞浆中Zn2+水平的提高做出响应。荧光图片还显示细胞核中仍未有明显荧光分布，而已有研究表明ZnSO4/吡啶硫酮孵育可以有效提高HeLa细胞核内的自由Zn2+水平[39]，因此ZnSO4/吡啶硫酮孵育后核中无荧光表明BDP-m-BPA探针在核中没有分布。负载有外源Zn2+的HeLa细胞的Zn2+脱除是利用具有胞内金属离子螯合能力的TPEN孵育完成的。荧光造影发现胞浆中荧光相比图12c中荧光明显降低(图12d)，总体荧光强度甚至略低于图12b中胞浆中荧光强度。这一结果不仅表明TPEN可有效降低胞浆中的自由Zn2+水平，同时也表明BDP-m-BPA在胞浆中可以实现对Zn2+的可逆响应。

3 结 论

本文通过在BODIPY荧光团的meso-位引入Zn2+螯合团和α-位引入(4-羟基)苯乙烯基构建了一个增强型Zn2+荧光探针BDP-m-BPA。探针分子显示了特异性的 Zn2+荧光增强响应，可在 0.12～1.2 μmol·L-1范围内线性响应Zn2+。与普通BODIOY类探针相比其激发和发射均出现了明显的红移 (激发红移近～30 nm，发射红移～70 nm)，同时 Stokes位移达到～50 nm(本征发射)，有利于降低造影中的自发荧光干扰和光毒性，尤其有助于降低普通BODOPY类探针由于Stokes位移小造成的激发干扰。荧光共聚焦造影表明BDP-m-BPA具有良好的细胞膜通透性，可对胞浆中自由Zn2+水平的变化实现可逆跟踪。本研究不仅发展了一个新的BODIPY类Zn2+荧光探针，而且表明α-(4-推电子基)苯乙烯取代是增强分子ICT效应实现探针激发/发射波长向红移动和增大Stokes位移的有效手段，有望进一步扩大BODIPY类荧光探针的应用。

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