高效液相色谱法测定维药蜀葵花中芦丁和紫云英苷含量

勉强辉， 郑大成， 孙 莲

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011； 2湖北钟祥市中医医院， 湖北 钟祥 431900)

蜀葵花为锦葵科蜀葵属植物蜀葵[Althaearosea(Linn.)Gavan]的干燥花朵，全草入药，味甘甜，性凉，有和血止血、解毒散结的功能,主治吐血、衄血、月经过多、赤白带下、二便不通、小儿风疹等[1]。蜀葵花收载于1993年版《维吾尔药材标准》(上册)[2]和1999年版《维吾尔药材标准》(下册)[3]，其具镇静安神、止咳平喘、发汗透疹之功效。国内外学者对其同属植物报道较多，其化学成分主要含黄酮类化合物[4-8]。冯育林等[9]和Gudej等[10]从蜀葵属中得到芦丁等7种黄酮化合物，并从蜀葵中获得紫云英苷。目前为止，有关蜀葵花中芦丁和紫云英苷含量测定的研究尚未见报道。本研究建立了高效液相色谱法测定维吾尔药材蜀葵子中芦丁和紫云英苷含量的方法，为维药材蜀葵花及其制剂的质量评价提供科学依据，为进一步开发和利用维吾尔药材资源提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(日本岛津，LC-20AT)，检测器(日本岛津，SPD-M20A)，电子分析天平(德国赛多利斯，BP-211D)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200DB)。

1.2 试药

乙腈(Chromadex，色谱纯)，甲醇(天津科密欧公司，色谱纯)，磷酸(北京红星化工厂，优级纯)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-201009，纯度≥98.0%)，紫云英苷对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号110328，纯度≥98.0%)。蜀葵花药材购自乌鲁木齐当地维药药店(批号：20110815、20120116、20120328)，经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为锦葵科蜀葵属植物蜀葵[Althaearosea(Linn.)Gavan]的干燥花朵。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱： YMC-Pack ODS-A C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长360 nm，以流动相A (0.2%磷酸水溶液)和流动相B (0.2%磷酸乙腈溶液)进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：洗脱时间分别为0～9、9～20、20～30、30～40、40～50、50～60 min；流动相A分别为85～80、80～75、75～65、65～60、60～85、85%。流速0.6 mL/min，进样量10 μL。理论塔板数按芦丁和紫云英苷色谱峰计算均不低于 3 000，对照品及样品色谱图见图1、2。

2.2 对照品储备液的制备

分别精密称取芦丁对照品和紫云英苷对照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取蜀葵花粉末(过四号筛)约0.2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇约15 mL，超声处理(功率250 W，频率30 KHz)30 min，放冷，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 线性关系考察

根据蜀葵花中芦丁和紫云英苷的含量差异，分别精密吸取上述对照品储备液适量，加甲醇制备系列混合对照品溶液(芦丁和紫云英苷一一对应的浓度分别为：0.5、1.0 μg/mL；1.5、2.0 μg/mL；3.0、4.0 μg/mL；4.5、8.0 μg/mL；6.0、12.0 μg/mL)，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定色谱峰面积。以峰面积A为纵坐标，待测成分浓度C(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。结果，芦丁和紫云英苷的回归方程分别为：A=583.5C-0.623，r=0.999 5,A=628.3C-0.270，r=0.999 1。芦丁和紫云英苷进样浓度分别在0.5～6.0 μg/mL和1.0～12.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取同一份芦丁(浓度3.0 μg/mL)和紫云英苷(浓度4.0 μg/mL)的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次。结果，芦丁和紫云英苷色谱峰峰面积的RSD(n=6)分别为1.8%和0.90%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批蜀葵花样品(批号：20120116)粉末约0.2 g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果，芦丁和紫云英苷色谱峰峰面积的RSD(n=6)分别为1.79%和1.81%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批蜀葵花样品(批号：20120116)粉末约0.2 g，共6份，精密称定，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，芦丁和紫云英苷含量的RSD(n=6)分别为1.0%和2.0%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批蜀葵花样品(批号：20120116)粉末6份，每份取约0.1 g，精密称定，准确加入芦丁和紫云英苷对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按““2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果，芦丁和紫云英苷的平均加样回收率(n=6)分别为102.3%和100.8%，RSD分别为0.89%和0.60%。

2.9 样品含量测定

取蜀葵花药材粉末约0.2 g，各3份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取各供试品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定芦丁和紫云英苷色谱峰面积，计算。结果，蜀葵花中芦丁和紫云英苷的含量分别为0.30～0.32 mg/g和0.43～0.46 mg/g，结果见表1。

表1 蜀葵花中芦丁和紫云英苷的含量/(mg/g)

3 讨论

依据《中国药典》(2010版)[11]中黄蜀葵花药材质量标准含量测定项下供试品溶液制备方法，以甲醇为提取溶剂，对提取时间进行了考察，分别超声10、20、30 min，最终以超声提取时间20 min为佳。

本研究参照文献[12]的方法，先采用0.2%磷酸水溶液-乙腈为流动相，后来发现在乙腈中加入适量的磷酸可以改善分离效果，最终确定0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱。

蜀葵花收载于1993年版《维吾尔药材标准》(上册)和1999年版《维吾尔药材标准》(下册)，其质量标准中缺乏含量测定项。本研究利用高效液相色谱建立了维药蜀葵花中芦丁和紫云英苷的含量测定方法。结果显示，此方法操作稳定，重复性良好，为维药蜀葵花药材的质量控制和评价提供一种快速、简便的分析方法，为进一步完善维吾尔药材蜀葵花质量标准提供了技术支持。

参考文献：

[1] 国家中药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M]. 上海:上海科技出版社, 1999:1251-1255.

[2] 刘勇民. 维吾尔药志:上册[M]. 乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社, 1993:372-373.

[3] 刘勇民. 维吾尔药志:下册[M]. 乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社, 1999:883-884.

[4] 陈秋, 吴春华, 葛丹丹, 等. 蜀葵花总黄酮正交提取工艺研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2012, 14(8):35-37.

[5] 张祎, 陈秋, 刘丽丽, 等. 维药蜀葵花化学成分的分离与结构鉴定(Ⅰ) [J]. 沈阳药科大学学报, 2013, 30(5):335-341.

[6] 李春梅, 王涛, 张祎, 等. 中药黄蜀葵花化学成分的分离与鉴定(Ⅱ) [J]. 沈阳药科大学学报, 2010, 27(10):803-807.

[7] 李春花, 刘雪丽, 郑文丽, 等. 正交试验优选黄蜀葵花中总黄酮的提取工艺[J].中国药房, 2013, 24(27):2535-2537.

[8] 周雷. 黄蜀葵花总黄酮研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报, 2012, 14(6):42-44.

[9] 冯育林, 徐丽珍, 杨世林, 等. 蜀葵花的化学成分研究(Ⅱ)-黄酮类成分研究[J]. 中草药, 2005, 36(11):1610-1612.

[10] Gudej J, Bieganowsk ML. Chromatographic investigations of flavonoids in the leaves and flowers of some species of the genus Althaea[J]. Chromatogra, 1990, 30(5-6):333-336.

[11] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:一部[S]. 北京:中国医药科技出版社, 2010:287.

[12] 刘龙,孙莲,杨文菊,等.桑叶药材高效液相色谱指纹图谱分析[J]. 新疆医科大学学报, 2008, 31(5):585-587.